रक्त और संस्कृति मीडिया से प्राप्त exosomes के शोधन और microRNA रूपरेखा
Summary
exosomes में स्थिर (miRNAs) microRNAs की उपस्थिति बायोमार्कर के रूप में और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए एक मार्ग के रूप में अपनी क्षमता उपयोगिता के लिए, कहनेवाला संचार का एक उपन्यास विधा के रूप में अपार रुचि उत्पन्न की है. यहाँ हम ले जाया जा रहा miRNAs की पहचान करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर द्वारा पीछा रक्त और संस्कृति मीडिया से exosome शुद्धि प्रदर्शित करता है.
Abstract
Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.
Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.
Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media
Introduction
लघु noncoding miRNAs लक्ष्य mRNA के बंधन से जीन अभिव्यक्ति मिलाना. ~ 7 बेस जोड़े के बीज अनुक्रम पूरक अनुवाद के निषेध में या लक्ष्य 1 प्रोटीन की कमी हुई अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं, जो दोनों की mRNA की स्थिरता में कमी में जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य mRNA के लिए बाध्य करने के लिए miRNA के लिए सक्षम बनाता है. पिछले दशक में अनुसंधान स्पष्ट सेलुलर कार्यों मध्यस्थता में miRNAs के लिए एक मौलिक भूमिका साबित कर दी है. भी विभिन्न रोगों 2,3 अंतर्निहित miRNA मध्यस्थता आणविक परिवर्तन विदारक ओर निर्देशित काफी प्रयास किया गया है. इसके अलावा, शारीरिक तरल पदार्थ 4-6 में स्थिर miRNAs की ही पहचान नैदानिक निदान करने के लिए उत्तरदायी उपन्यास बायोमार्कर के रूप में उनके उपयोग के लिए रास्ता बनाया.
शारीरिक तरल पदार्थ में miRNA परिवहन की एक विधा प्रणालीगत रक्त circulat के माध्यम से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को exosomes, mRNAs ले कि छोटे फफोले, प्रोटीन, लिपिड मध्यस्थों और miRNAs माध्यम हैआयन 7-14. प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के मॉडुलन में और यह परिणाम सेलुलर संचार का एक उपन्यास तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं वृद्धि कारक β5 (TGFβ5) बदलने, स्रावित और / या ऐसे इंटरल्यूकिन 1β (IL1β), ट्यूमर परिगलन कारक-α (TNFα) के रूप में सूजन में शामिल biomolecules युक्त अवशोषित exosomes द्वारा प्रतिरक्षा नियामक प्रक्रियाओं को व्यवस्थित करना है, और कर सकते हैं इन जीनों में 13 को विनियमित कि miRNAs. न्यायपालिका miRNA अभिव्यक्ति मानव रोगों की एक किस्म में एक आम सुविधा है, इन अणुओं उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य 2 की खोज और सत्यापन के लिए रोमांचक नए अवसर प्रदान करते हैं.
घूम miRNAs सब शरीर के तरल पदार्थ में मौजूद हैं और यह exosomes की रचना वे जारी किए गए जिसमें से स्रोत कोशिकाओं के आधार पर अलग है कि जाना जाता है. इस प्रकार वे कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं और कैसे कोशिकाओं को भी संकेत को बदलरोगों सहित तनाव के जवाब में टीएस. Exosome संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के संकेत पारगमन में अंतर्दृष्टि प्रदान और बायोमार्कर या चिकित्सकीय हस्तक्षेप के मार्गों के रूप में अपनी क्षमता उपयोगिता की जांच कर सकते हैं.
यहाँ हम प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित कई स्रोतों से exosomes की शुद्धि प्रदर्शन करेंगे. इन exosomes exosomes में मौजूद miRNAs के स्तर की पहचान और मापने के लिए qPCR के द्वारा पीछा शाही सेना अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम रक्त और संस्कृति मीडिया से अंतर centrifugation द्वारा शुद्ध exosomes से miRNAs और mRNAs की मात्रा का ठहराव दिखा. Exosomes उनके मूल पर निर्भर विभिन्न घटकों है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, प्रतिजन प्रस्तुति, इंट्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन रीटा एलन फाउंडेशन अनुदान से seena अजीत को धन के द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों साधन के प्रयोग, वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता के लिए दक्षिण कैरोलिना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर के विश्वविद्यालय से एरिका बालोघ और डॉ. सौमित्र Ghoshroy स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
Referências
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