혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일
Summary
exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.
Abstract
안정되어있는 miRNA의 모든 체액에 존재하는 어떤 순환의 miRNAs는 exosomes라는 작은 소포에 격리에 의해 분해로부터 보호됩니다. Exosomes는 대상 세포에 RNA와 단백질의 이동의 결과 세포막과 융합 할 수 있습니다. 자신의 생물학적 기능은 면역 반응, 항원 프레 젠 테이션 및 세포 통신을 이용하실 수 있습니다. 혈액을 통해받는 사람 세포에서 유전자 발현을 조절할 수있는 miRNA의 배달 대상의 개입에 대한 새로운 길을 열었습니다. 약물이나 RNA 치료제의 전달을위한 전략을 제공 할뿐 아니라, exosomal 내용은 처리 옵션 및 예후를 결정하는 진단에 도움이 될 수 있습니다 생체 역할을 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes는 EXOS을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다관심의 mRNA에 대한 OMAL 마커와 PCR. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.
이러한 프로토콜은 약물 개입 전후 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 V 표시miRNA에있는 ariations 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 제시한다.
여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes의 관심의 mRNA에 대한 exosomal 마커와 PCR을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.
이러한 프로토콜은 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수있는 전약물 개입 전후 N 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터의 miRNAs의 변화 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 존재하는 표시
Introduction
짧은 비 암호화의 miRNAs는 대상의 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 조절. ~ 7 기본 쌍의 씨앗 시퀀스 보완은 번역의 억제 또는 대상 단백질 1의 감소 표현 될 수 있습니다 둘 다의 mRNA의 안정성 감소의 결과로 대상의 mRNA에 결합하는 miRNA의 수 있습니다. 지난 10 년간 연구 명백하게 세포 기능을 중재에 miRNA에 대한 근본적인 역할을 입증했다. 또한 각종 질병에게 2,3 기본 miRNA의 매개 분자 변화를 해부쪽으로 이동 상당한 노력이 있었다. 또한, 체액 4-6에서 안정 miRNAs는 최근 식별 임상 진단 의무 새로운 바이오 마커 등의 사용에 대한 방법을 용이하게했다.
체액의 miRNA의 전송 모드 하나는 조직의 혈액 circulat를 통해받는 세포에 exosomes, mRNA를 운반 작은 소포, 단백질, 지질 매개체, 그리고 miRNA에 경유이온 7-14. 받는 사람 세포에서 유전자 발현의 변조,이 결과는 세포 통신의 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 예를 들어, 세포 성장 인자-β5 (TGFβ5)를 변환, 분비 및 / 또는 인터루킨-1β (IL1β), 종양 괴사 인자-α (TNFα)와 같은 염증과 관련된 생체 분자를 포함하는 흡수 exosomes가 면역 조절 과정을 조절하고 있습니다 이러한 유전자에게 13 조절하는 miRNA에. 탈선 miRNA의 발현은 인간의 질병의 다양한 일반적인 기능이기 때문에, 이러한 분자는 새로운 치료 표적 (2)의 발견과 검증을위한 새롭고 흥미로운 기회를 제공합니다.
순환의 miRNAs의 모든 체액에 존재하며 그것은 exosomes의 조성이 발매 된에서 원본 셀에 따라 다른 것으로 알려져있다. 따라서 그들은 세포의 생리적 상태를 연구하는 수단을 제공하는 방법과 세포도 신호 alter입니다질병 등 스트레스 님의 질문에 답변 TS. exosome 구성의 변화를 공부하는 것은 신호 전달에 대한 통찰력을 제공하고 생체 또는 치료 적 개입 경로로 자신의 잠재력 유틸리티를 조사 할 수 있습니다.
여기 게시 된 프로토콜에 따라 여러 소스에서 exosomes의 정화를 보여줍니다. 이러한 exosomes는 exosomes에 존재하는 miRNA에의 수준을 파악하고 측정하는 qPCR에 이어 RNA 분리에 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 혈액과 문화 미디어 차등 원심 분리하여 정제 exosomes에서의 miRNAs과의 mRNA의 정량을 보여줍니다. Exosomes는 그들의 기원에 의존 다양한 구성 요소가 면역 반응, 항원 제시 세포 내 통신 및 RNA와 단백질 9,11,12,19,20의 전송을 포함한 생물학적 기능의 숫자에 참여하고 있습니다. 크기와 모양이 exosome 순도의 결정이지만, EM에게 exosomes의 데이터를 표시 논문의 숫자는이 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 리타 알렌 재단 보조금에서 Seena 아지트에 기금에 의해 지원되었다. 저자는 장비 사용, 과학 및 기술 지원을위한 사우스 캐롤라이나 전자 현미경 센터의 대학에서 에리카 Balogh 다음과 박사 Soumitra Ghoshroy을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
Referências
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