स्लाइस संस्कृतियों जीन और औषधीय perturbations से भ्रूण के विकास के हेरफेर की सुविधा. हालांकि, संस्कृति की स्थिति सुनिश्चित करना चाहिए कि सामान्य विकास टुकड़ा की कमी पर्यावरण के भीतर कार्रवाई कर सकते हैं. हम एक प्रोटोकॉल है कि सामान्य रीढ़ की हड्डी के विकास की सुविधा के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए आगे बढ़ना वर्णन.
स्लाइस संस्कृतियों भ्रूण के विकास के हेरफेर की सुविधा दोनों औषधीय और जीन जोड़तोड़ के माध्यम से कर सकते हैं. इस प्रणाली में कम संभावित घातक पक्ष प्रभाव प्रणालीगत दवा अनुप्रयोगों के कारण को दूर किया जा सकता है. हालांकि, संस्कृति की स्थिति टुकड़ा के कम पर्यावरण के भीतर है कि सामान्य विकास आय सुनिश्चित करना चाहिए. हम रीढ़ की हड्डी के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है, विशेष रूप से रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स की. हम व्यवस्थित बिंदु है जिस पर सबसे रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स पैदा हुआ था से चिकन भ्रूण स्लाइस की संस्कृति की स्थिति अलग है. हम और मोटर न्यूरॉन्स कि vivo में तुलना संस्कृति अवधि और उन मोटर न्यूरॉन्स की स्थिति के दौरान बच की संख्या प्रकार assayed. हमने पाया है कि सीरम प्रकार और neurotrophic कारकों संस्कृति अवधि के दौरान आवश्यक थे और कम से कम 24 घंटे के लिए मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने के लिए और उन मोटर न्यूरॉन्स में उपयुक्त पदों को विस्थापित करने की अनुमति के लिए करने में सक्षम थेरीढ़ की हड्डी है. हम इन संस्कृति शर्तों और भ्रूण टुकड़ा eviscerated चिकन agarose में एम्बेडेड भ्रूण का उपयोग संस्कृतियों की तैयारी की पद्धति मौजूद है और एक vibratome का उपयोग कर कटा हुआ.
सामान्य भ्रूण के विकास के दौरान, कई अलग अलग प्रकार के सेल उत्पन्न कर रहे हैं जो मूल की उनकी बात से जहाँ वे अंततः परिपक्व जीव में कार्य करेगा विस्थापित चाहिए. विकासशील रीढ़ की हड्डी के भीतर, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं पर midline वेंट्रिकुलर क्षेत्र में स्थित हैं और कई उपप्रकारों उत्पन्न postmitotic न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं है जो कार्यात्मक neuronal संवेदी प्रसंस्करण और मोटर outputs 1 के लिए आवश्यक सर्किट में एकीकृत करने की ओर पलायन करना चाहिए. रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स कि अंग की मांसपेशियों के संकुचन नियंत्रण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और बहुत अणु और तंत्र कि उनके विभिन्न उपवर्गों के गठन ड्राइव से जाना जाता है. हालांकि, बहुत कम तंत्र है जिसके द्वारा मोटर न्यूरॉन्स को विस्थापित करने के लिए, अलग और synaptic आदानों प्राप्त की जाना जाता है.
मोटर न्यूरॉन subtype एक पदानुक्रमित फैशन में विकास के दौरान पहचान हासिल कर ली है. मोटर न्यूरॉन उपप्रकारों मोटे तौर पर मैं वर्गीकृत कर सकते हैंNto अलग कॉलम, डिवीजनों और पूल के है जो अपने अक्षतंतु अनुमानों से परिभाषित कर रहे हैं. या तो axial, आंत या अंग की मांसपेशियों के लिए मोटर परियोजना axons स्तंभ. मोटर डिवीजनों ventral या पृष्ठीय मांसपेशियों के लिए 2 पेश करने वालों में पार्श्व मोटर स्तंभ (LMC) मोटर न्यूरॉन्स पेश अंग प्रतिभाग. प्रभागों के भीतर, मोटर न्यूरॉन्स के समूहों अंग 2, 3 में व्यक्ति की मांसपेशियों के लिए मोटर पूल परियोजना करार दिया. अंग पेश मोटर न्यूरॉन्स प्रतिलेखन कारक Foxp1 4, 5 उनकी अभिव्यक्ति से परिभाषित कर रहे हैं, जबकि प्रभागीय पहचान प्रतिलेखन homeodomain (औदरीयता पेश) आइलेट-1 या LHX 1 कारकों (पृष्ठीय पेश) 6 की अभिव्यक्ति के द्वारा होती है. दरअसल, LHX-1 अभिव्यक्ति की मोटर न्यूरॉन्स 7 उपयुक्त पृष्ठीय अनुमानों के लिए आवश्यक है. इन उपप्रकारों में से प्रत्येक रीढ़ की हड्डी के भीतर अलग पदों पर कब्जा, उदर पेश मोटर न्यूरॉन्स पृष्ठीय projecti औसत दर्जे का रहते आएएनजी मोटर न्यूरॉन्स. LMC में यह परिणाम तथाकथित (LMCm) LMCmedial और LMClateral डिवीजनों (LMCl) में बांटा जा रहा है. संभागीय और मोटर पूल संगठन दो 8 चरणों में अधिग्रहण कर लिया है. पहले चरण में, प्रभागीय अलगाव एक पार्श्व फैशन के लिए औसत दर्जे विशेषता में मोटर न्यूरॉन्स के माइग्रेशन के माध्यम से हासिल की है. LMCl कोशिकाओं LMCm कोशिकाओं और इतने LMCl LMCm के माध्यम से migrates अपने अंतिम निपटाने की स्थिति को प्राप्त करने के बाद उत्पन्न होता है. दूसरे चरण में एक और मोटर न्यूरॉन पूल में विभाजन उन्हें समूहों के भीतर मोटर न्यूरॉन्स लेता है, शायद एक मोटर न्यूरॉन्स की छँटाई पृष्ठीय उदर के माध्यम से. Catenin निर्भर शास्त्रीय cadherin परिवार के सदस्यों को मोटर न्यूरॉन संगठन 8-10 के दोनों चरणों के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है. हालांकि, कैसे cadherin समारोह सेल आंदोलन नियंत्रण खराब समझा जाता है.
खानेदार प्रभागीय, और पूल पहचान के अधिग्रहण बाह्य संकेतों की आवश्यकता है कि पैटर्न intrinsiग प्रतिलेखन 11 कारकों की अभिव्यक्ति. इसके अतिरिक्त, सभी मोटर न्यूरॉन्स की 50% के आसपास सामान्य विकास के दौरान apoptosis के माध्यम से एक प्रक्रिया है कि अंग से बाह्य संकेतों की आवश्यकता में मोटर न्यूरॉन अस्तित्व के neurotrophic समर्थन के माध्यम से बड़े पैमाने पर मर जाते हैं,. इस प्रकार, मोटर न्यूरॉन विकास करने के लिए उपयुक्त एक अपेक्षाकृत लंबे timecourse पर बनाए रखा जा वातावरण की आवश्यकता है. इस कारण से, रीढ़ की हड्डी टुकड़ा संस्कृतियों पैदा करने के लिए मोटर न्यूरॉन अस्तित्व को बनाए रखने के practicalities उपयुक्त संस्कृति शर्तों की व्याख्या की आवश्यकता होती है. पिछले भ्रूण टुकड़ा संस्कृतियों बाहर से जोड़ा neuronal आबादी 12-14 शुद्ध व्यवहार का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, हमारे ज्ञान संस्कृति शर्तों कि टुकड़ा के भीतर ही स्वस्थानी मोटर न्यूरॉन अस्तित्व और माइग्रेशन में सुविधा के लिए प्रकाशित नहीं किया गया है. हम एक मानक संस्कृति हालत कि विशुद्ध अस्तित्व की सुविधा संशोधित, dissociated कपाल मोटर न्यूरॉन्स मीटर की सुविधा के लिएएक भ्रूण टुकड़ा संस्कृति प्रणाली के भीतर otor न्यूरॉन विकास. हम भी जीवित मोटर न्यूरॉन्स की स्थिति पर नजर रखी और दिखाना है कि मोटर न्यूरॉन डिवीजनों के काफी हद तक सामान्य पदों संस्कृति अवधि के दौरान अर्जित है.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक चिकन भ्रूण टुकड़ा whilst मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने और संस्कृति की अवधि के दौरान विस्थापित जारी करने के लिए एक दिन से अधिक के लिए incubated की अनुमति देता है. शर्तों elucidating मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने में, हम कई महत्वपूर्ण आवश्यक सुविधाओं की पहचान की है. ऐसा लगता है कि ऊपर 4% से लड़की सीरम मोटर न्यूरॉन्स और एक अलग प्रजाति से सीरम के साथ अपने प्रतिस्थापन के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है बर्दाश्त नहीं है. दिलचस्प है, हमने पाया है कि सीरम के उच्च सांद्रता की उपस्थिति स्लाइस के रूप में वे टुकड़ा आकार में सकल विकृतियों के प्रमुख ऊतक के अतिवृद्धि को बढ़ावा के लिए हानिकारक थे. अधिक महत्वपूर्ण बात, cilliary neurotrophic कारक की उपस्थिति भी महत्वपूर्ण साबित हुआ. यह एक अलग संभावना है है कि स्लाइस काफी लंबी अवधि के लिए सिर्फ 24 घंटा से संवर्धित किया, शायद यह भी अनुमति संवेदी अभिवाही इनपुट की रीढ़ की हड्डी को दृश्य करने में सक्षम हो सकता है रहता है. इसके अतिरिक्त, संस्कृतिture यहाँ की स्थिति भी विकासशील brainstem मध्यमस्तिष्क और / सेरिबैलम की संस्कृतियों का टुकड़ा करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है.
शायद इन टुकड़ा संस्कृति शर्तों के उपयोग में सबसे बड़ा संभावित लाभ है कि वे भ्रूण के बाकी पर दिल के रूप में प्रतिकूल प्रभाव के लिए क्षमता को कम करने whilst प्रोटीन समारोह के औषधीय हेरफेर के लिए संभावना की सुविधा है. और inhibitors agonists के अलग संकेत दे रास्ते की एक बड़ी संख्या में विभिन्न रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन subtypes के प्रवास और संभावित, स्थानीय विकास के दौरान रीढ़ की हड्डी में सर्किट के गठन के अपने प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति की कुछ आनुवंशिक perturbations, उन है कि siRNAs और morpholino oligonucleotides प्रयोग कर के रूप में, तथ्य यह है कि वे केवल विकास में जल्दी शुरू किया जा सकता है (सीमाओं के कारण में ओवो electroporation प्रक्रियाओं में) और प्रभाव के लिए ही पिछले से पीड़ित टिम की एक छोटी अवधिई (आम तौर पर एक दिन). हमारे टुकड़ा संस्कृति बाद के चरणों में शुरू कर दिया है और इस प्रौद्योगिकी के विकास में बाद में टुकड़ा करने की क्रिया स्तर पर टुकड़ा की संस्कृति की अवधि के दौरान अपने प्रभाव को देखने के लिए उपयोग करने की संभावना affords.
टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल भी दोनों रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के माध्यम से वास्तविक समय में पृष्ठीय interneuron प्रवास के दृश्य की अनुमति दे सकता है. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग सफेद रोशनी के नीचे या प्रतिदीप्ति इमेजिंग के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. यदि बाद तकनीक फिर से इस्तेमाल किया जा रहे थे फ्लोरोसेंट लेबल की शुरूआत की जरूरत है. फ्लोरोसेंट रंजक के DiI या DIO रूप में लागू होने से या तो किया जा सकता है या तो अंग या वेंट्रिकल से या constructs न्यूरॉन्स की एक सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्राइव ओवो electroporation में अग्रगामी लेबलिंग से प्रतिगामी लेबलिंग के माध्यम से हासिल की है.
The authors have nothing to disclose.
हम कई व्यावहारिक विचार – विमर्श और बी Novitch के लिए एंटीबॉडी की तरह का उपहार के लिए शेरोन घमंड Foxp1 के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के रूप में वेलकम ट्रस्ट से एक छात्रवृत्ति KCT और वेलकम ट्रस्ट से एसआरपी (अनुदान संदर्भ संख्या 094399/B/10/Z) एक परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
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24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |