Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.
Dilim kültürleri hem farmakolojik ve gen manipülasyonu yoluyla embriyo gelişiminin manipülasyon kolaylaştırabilir. Bu düşük sistem olarak, sistemik ilaç uygulamaları nedeniyle potansiyel öldürücü yan etkilerin önüne alınabilir. Ancak, kültür koşulları dilim azaltılmış ortamında normal gelişimini devam sağlamalıdır. Biz özellikle spinal motor nöronların olduğunu, omurilik gelişimi üzerine odaklanmıştır. Biz sistematik en spinal motor nöronlarda doğmuştu hangi noktadan tavuk embriyo dilim kültür koşulları değişmiştir. In vivo kıyasla kültür periyodu ve bu motor nöronların hayatta pozisyon sırasında motor nöron sayısı ve türü ölçüldü. Serum türü ve nörotrofik faktörler kültür döneminde istendi bulundu ve en az 24 saat süreyle motor nöronların canlı tutmak ve bu motor nöronlar uygun pozisyonları göç etmelerine izin başardıkomurilik. Biz bu kültürü koşulları ve agaroz gömülü parçalanmış tavuk embriyoları kullanılarak embriyo dilim kültürü hazırlama metodolojisi sunmak ve vibratome kullanarak dilimlenmiş.
Normal embriyo gelişimi sırasında, birçok farklı hücre tipleri geldikleri noktadan onlar sonunda olgun organizmada işleyecektir nereye göç gereken oluşturulur. Gelişmekte olan spinal kord içinde, öncü hücreler orta hatta ventriküler bölgesinde bulunan ve duyusal işleme ve motor çıkışları 1 için gerekli işlevsel nöral devrelerin entegre geçirmek gerekir postmitotik nöronlar ve glial hücrelerin birçok alt tipi oluşturmak vardır. Ekstremite kaslarının kasılması kontrol Spinal motor nöronlar kapsamlı araştırmalar yapılmış ve çok onların farklı alt oluşumunu tahrik molekülleri ve mekanizmaları bilinmektedir. Ancak, daha az motor nöronlar, göç ayırma ve sinaptik girişleri almak hangi mekanizmaların bilinmektedir.
Motor nöron alt kimlik hiyerarşik bir biçimde gelişimi sırasında elde edilir. Motor nöron alt kabaca i kabul edilebilirnto farklı sütunlar, onların akson projeksiyonları tarafından tanımlanır bölünmeler ve havuzlar. Eksenel, visseral veya ekstremite kasları birine Motor sütunları projesi aksonlar. Motor bölünmeler ventral veya dorsal kaslara 2 projelendirme bu içine yanal motorlu sütun (LMC) ve motor nöronları projelendirme uzuv ayırabiliriz. Bölünmeler içinde, motor nöron kümeleri ekstremite 2, 3 bireysel kasları için motor havuzu projesi adlandırılır. Bölünmüş kimlik Homeodomain transkripsiyon faktörleri Islet-1 (ventral öngörülmesi) ya da LHX-1 (dorsal olarak çıkıntı) 6 ifade ile karakterizedir Bacak verme motor nöronları, transkripsiyon faktörü Foxp1 4, 5 onların ifade ile tanımlanır. Gerçekten de, LHX-1 ekspresyonu, motor nöronlarının 7 uygun dorsal projeksiyonlar için gereklidir. Bu ayrımlardan Her omurilik içinde farklı mevkilere; ventral çıkıntılı motor nöronlar dorsal projecti medial ikamet gelmekng motor nöronlar. LMC Bu sonuçlar sözde LMCmedial (LMCm) ve LMClateral (LMCl) bölüme ayrılmış olan. Tümen ve motor havuzu organizasyonu iki aşamada 8 kazanılır. İlk aşamada, tümen segregasyon yanal moda medial karakteristik motor nöronların bir göç yoluyla elde edilir. LMCl hücreler LMCl nihai oturması konumu elde etmek için LMCm boyunca göç böylece LMCm hücreleri ve sonra üretilir. İkinci aşamada motor nöronların bir dorsal-ventral sıralama yoluyla, muhtemelen motor nöron havuzlarında bir bölünme ve kümeler içlerindeki motor nöronları alır. Katenin bağımlı klasik kaderin ailesinin üyeleri motor nöron organizasyonu 8-10 her iki aşamasında çok önemli olduğu gösterilmiştir. Ancak, kaderin işlevi hücre hareketi nasıl kontrol tam anlaşılamamıştır.
Kolumnar, tümen ve havuz kimliklerin edinimi ekstrinsik sinyalleri gerektirir desen intrinsitranskripsiyon faktörleri 11 c ifadesi. Ayrıca, tüm motor nöronların yaklaşık% 50 oranda motor nöron sağkalımı nörotrofik desteği sayesinde, daldan ekstrinsik sinyallerin gerektiren bir süreçtir, normal gelişim sırasında apoptozis ile ölürler. Böylece, motor nöron gelişme nispeten uzun bir timecourse üzerinde muhafaza edilmesi için uygun ortam gerektirir. Bu nedenle, motor nöron hayatta kalma korumak için omurilik kesit kültürlerinde üretme pratik uygun kültür koşulları açıklama gerektirmez. Önceki embriyo kesit kültürlerinde nöronal popülasyonları 12-14 dışsal ilave saflaştırılmış davranış takip için kullanılmıştır. Ancak, dilim kendi içinde in situ motor nöron sağkalım ve göç kolaylaştırmak bizim bilgi kültür koşullarına yayınlanmış değil. Biz saflaştırılmış sağkalım kolaylaştıran bir standart kültür koşulu değiştirilmiş, disosiye kranial motor nöronlar m kolaylaştırmak içinbir embriyo dilim kültürü sistemi içinde otor nöron gelişimi. Biz de kalan motor nöron konumlandırma izlenmekte ve motor nöron bölünmeler çoğunlukla normal pozisyonları kültür dönemi süresince edinilen olduğunu göstermektedir.
Burada açıklanan protokol, bir tavuk embriyo dilim motor nöronların canlı kalmasını sağlar ve kültür dönemi sırasında göç etmeye devam ederken, birden fazla gün için inkübe edilmesini sağlar. Motor nöronlar canlı tutmak için şartları aydınlatılmasına, biz gerekli bazı temel özellikleri belirledik. O kadar 4% civciv serum motor nöronlar ve farklı türlerden serum ile onun yerine hayatta kalması için kritiktir tolere değil gibi görünüyor. İlginçtir, biz serum yüksek konsantrasyonlarda varlığı, dilim şeklinde brüt bozulmalara yol açan doku büyümesi olarak terfi dilimleri için zararlı olduğunu bulmuşlardır. Daha da önemlisi, cilliary nörotrofik faktörün varlığı da önemli rol oynadı. Bu dilimler hatta omuriliğe duyusal afferent girdi görselleştirme sağlayan, sadece 24 saat çok daha uzun süre kültüre edilmesi mümkün olabilir o ayrı bir olasılık kalıyor. Buna ek olarak, kültürBurada Ture koşulları da gelişmekte olan beyin sapı ve orta beyin / beyincik kültürleri dilim yararlı olabilir.
Belki de bu dilim kültür koşullarında kullanımında büyük potansiyel yararı da kalbi olarak embriyo geri kalanı üzerinde olumsuz etkiler, potansiyeli en aza indirgerken, protein fonksiyonu farmakolojik manipülasyon imkanı kolaylaştırmak olduğunu. Farklı sinyal yolunun inhibitörleri ve agonistleri çok sayıda farklı spinal nöronların alt göçü, ayrıca, gelişme sırasında lokal spinal devre oluşumu etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür siRNA'lar ve morfolino oligonükleotid kullanımı yaptığınız gibi protein ekspresyonu bazı genetik tedirginlikler, sadece erken gelişme olarak tanıtılan (ovo elektroporasyon işlemlerinde kısıtlamalar nedeniyle) ve için etkileri sadece son gerçeği muzdarip tim kısa bir süree (genellikle bir gün). Bizim dilim kültürü ileriki aşamalarında başladı ve dilim kültür döneminde etkilerini görmek için dilimleme aşamada sonraki gelişimi bu teknolojiyi kullanma imkanı tanıyor.
Kesit kültürü protokolü de hem spinal motor nöron yanı sıra zaman atlamalı video mikroskobu aracılığıyla gerçek zamanlı olarak dorsal interneuron göç görselleştirme izin verebilir. Bu beyaz ışık altında ya da floresan görüntüleme kullanımı ile faz kontrast mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. İkinci teknik sonra kullanılacak olursa floresan etiketler getirilmesi gereklidir. Bu ventrikülden veya nöronların bir alt kümesi içinde floresan proteinleri sürücü yapıları ovo elektroporasyon içinde uzuv veya anterograd etiketlemeden retrograd etiketleme ya üzerinden bu tür Dii veya Dio olarak floresan boyalar tanıtılması yoluyla elde edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Foxp1 için antikorların tür hediye için birçok anlayışlı tartışmalar ve B. Novitch için Sharon övünme teşekkür etmek istiyorum. KCT için Wellcome Trust bir öğrencilik ve Wellcome Trust SRP (Hibe referans numarası 094399/B/10/Z) bir proje hibe tarafından finanse edilen bu çalışma.
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |