Cultivos de cortes de facilitar la manipulación del gen por el desarrollo del embrión y las perturbaciones farmacológicos. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que el desarrollo normal puede proceder en el entorno reducido de la rebanada. Se ilustra un protocolo que facilita el desarrollo normal de la médula espinal para continuar durante al menos 24 h.
Cultivos de cortes puede facilitar la manipulación del desarrollo del embrión y farmacológicamente tanto a través de manipulaciones genéticas. En este sistema de reducción, los potenciales efectos secundarios letales debido a las solicitudes de fármacos sistémicos pueden ser superados. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que avanza el desarrollo normales dentro del entorno reducido de la rebanada. Nos hemos centrado en el desarrollo de la médula espinal, en particular la de las neuronas motoras espinales. Hemos variado sistemáticamente las condiciones de cultivo de las rebanadas de embrión de pollo desde el punto en el que las neuronas motoras espinales más había nacido. Analizamos el número y tipo de las neuronas motoras que sobrevivieron durante el período de cultivo y la posición de las neuronas motoras en comparación a que in vivo. Se encontró que el tipo de suero y factores neurotróficos se requiere durante el período de cultivo y fueron capaces de mantener las neuronas motoras vivo durante al menos 24 horas y permitir que las neuronas motoras a migrar a las posiciones adecuadas en lamédula espinal. Presentamos estas condiciones de cultivo y la metodología de preparación de los cultivos de cortes de embriones con embriones de pollo eviscerado embebidos en agarosa y en rodajas con un vibrátomo.
Durante el desarrollo embrionario normal, muchos tipos de células diferentes que se generan deben migrar desde su punto de origen hasta donde eventualmente funcionarán en el organismo maduro. Dentro de la médula espinal en desarrollo, las células progenitoras se encuentra en la zona ventricular en la línea media y generan muchos subtipos de neuronas postmitóticas y células gliales que deben migrar a integrarse en los circuitos neuronales funcionales requeridos para el procesamiento sensorial y la salida del motor 1. Las neuronas motoras espinales que controlan la contracción de músculos de las extremidades se han estudiado ampliamente y se sabe mucho de las moléculas y mecanismos que conducen a la formación de sus subclases diferentes. Sin embargo, se sabe mucho menos de los mecanismos por los cuales las neuronas motoras migran, segregar y recibir entradas sinápticas.
Motor identidad subtipo neuronal se adquiere durante el desarrollo de una manera jerárquica. Motor subtipos neuronales pueden ser ampliamente clasificados inPara distintas columnas, las divisiones y las piscinas que se definen por sus proyecciones axón. Motor columnas axones de proyectos a cualquiera de los músculos axiales, viscerales o la integridad física. Divisiones de motor subdividir la extremidad proyección de las neuronas motoras de la columna lateral del motor (LMC) en los que se proyecta a los músculos ventral o dorsal 2. Dentro de las divisiones, grupos de neuronas motoras motor denominado proyecto piscinas a los músculos individuales en el miembro 2, 3. Salientes de extremidad neuronas motoras se definen por su expresión del factor de transcripción FOXP1 4, 5, mientras que la identidad de división se caracteriza por la expresión de los factores de transcripción del homeodominio 1 Islet-(ventralmente proyección) o LHX 1-(dorsalmente proyectando) 6. En efecto, LHX-1 de expresión se requiere para las proyecciones apropiadas dorsal de las neuronas motoras 7. Cada uno de estos subtipos de ocupar distintas posiciones dentro de la médula espinal, las neuronas motoras ventrales proyectan venir a residir a medial dorsal projecting neuronas motoras. Esto resulta en la LMC siendo segregados en los llamados LMCmedial (LMCM) y divisiones LMClateral (LMCl). Organización piscina Divisional y el motor se adquiere en dos fases 8. En la primera fase, la segregación de división se consigue a través de una migración de las neuronas motoras en una característica medial a lateral de la moda. Las células LMCl se generan después de las células y así LMCM LMCl migra a través de la LMCM para alcanzar su posición de sedimentación final. La segunda fase se lleva neuronas motoras dentro de una división y agrupaciones ellos en conjuntos de neuronas motoras, presumiblemente a través de una clasificación dorsal-ventral de las neuronas motoras. Los miembros de la familia de las cadherinas catenina dependientes clásica han demostrado ser crucial para las dos fases de la neurona motora 8-10 organización. Sin embargo, como función de las cadherinas controla el movimiento celular se conoce bien.
La adquisición de la identidad columnar, de división y de piscina requiere que el patrón de señales extrínsecas intrínsecamentec expresión de factores de transcripción 11. Además, alrededor de 50% de todas las neuronas motoras mueren por apoptosis durante el desarrollo normal en un proceso que requiere señales extrínsecas de la extremidad, en gran parte a través de soporte neurotrófico de motor supervivencia de las neuronas. Por lo tanto, las neuronas motoras de desarrollo requiere un entorno adecuado que se mantenga en un timecourse relativamente largo. Por esta razón, los aspectos prácticos de la generación de cultivos de cortes de médula espinal para mantener la supervivencia de las neuronas del motor requieren la elucidación de las condiciones de cultivo apropiadas. Anterior cultivos de cortes de embriones se han utilizado para seguir el comportamiento de extrínsecamente añadido purificado poblaciones neuronales 12-14. Sin embargo, para nuestros conocimientos Condiciones de cultivo que facilitan in situ motor supervivencia neuronal y la migración dentro de la propia división no se han publicado. Hemos modificado una condición de cultivo estándar que facilita la supervivencia de purificada, disociadas neuronas motoras craneales para facilitar motor neurona desarrollo dentro de un sistema de cultivo de embriones rebanada. También supervisó la colocación de las neuronas motoras supervivientes y demostrar que las posiciones en gran parte normal de la división de la motoneurona se adquiere durante el período de cultivo.
El protocolo aquí descrito permite una rebanada de embrión de pollo que se incubaron durante más de un día, manteniendo las neuronas motoras vivo y continuo a migrar durante el período de cultivo. En la aclaración de las condiciones para mantener las neuronas motoras vivas, se han identificado varias características clave requeridas. Parece que hasta un 4% de suero de pollo es crítico para la supervivencia de las neuronas motoras y su sustitución con suero de una especie diferente no es tolerada. Curiosamente, hemos encontrado que la presencia de mayores concentraciones de suero fueron perjudiciales para las rebanadas, ya que promueven el crecimiento excesivo del tejido dando lugar a graves distorsiones en la forma de rebanada. Más importante aún, la presencia de factor neurotrófico ciliar también resultó crítica. Sigue siendo una clara posibilidad de que las rebanadas pueden ser capaces de ser cultivadas durante bastante más tiempo que sólo 24 hr, incluso permitiendo la visualización de la información sensorial aferente a la médula espinal. Además, el cultura condiciones también podrían ser útiles para cortar las culturas del tronco cerebral y el mesencéfalo desarrollo / cerebelo.
Quizás el mayor beneficio potencial en el uso de estas condiciones de cultivo rebanada es que facilitan la posibilidad de que la manipulación farmacológica de función de la proteína mientras que se minimiza el potencial de efectos adversos en el resto del embrión, tales como el corazón. Un gran número de inhibidores y agonistas de diferentes vías de señalización se puede utilizar para evaluar la migración de los diferentes subtipos de neuronas espinales y, potencialmente, su efecto de la formación de circuitos locales espinales durante el desarrollo. Además, algunas perturbaciones genéticas de expresión de la proteína, tales como los que hacen uso de siRNAs y oligonucleótidos de morfolino, sufren del hecho de que sólo puede ser introducido en el desarrollo temprano (debido a las limitaciones en los procedimientos de electroporación in ovo) y los efectos sólo duran un corto período de time (generalmente un día). Nuestra cultura rebanada se inicia en etapas posteriores y ofrece la posibilidad de utilizar esta tecnología en el desarrollo posterior en la etapa de corte para ver sus efectos durante el período de la cultura de la rebanada.
El protocolo de cultivo de cortes también podría permitir la visualización de ambas motoneurona espinal, así como la migración de interneuronas dorsal en tiempo real a través de microscopía de vídeo time-lapse. Esto podría conseguirse mediante microscopía de contraste de fase con luz blanca o mediante el uso de imágenes de fluorescencia. Si esta última técnica se iban a utilizar a continuación, la introducción de marcadores fluorescentes que se necesita. Esto puede lograrse ya sea mediante la introducción de tintes fluorescentes tales como Dil o DiO a través de cualquiera de marcado retrógrado de la extremidad o etiquetado anterógrada desde el ventrículo o la electroporación in ovo de constructos para conducir las proteínas fluorescentes en un subconjunto de neuronas.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a jactes Sharon para discusiones interesantes y muchas Novitch B. para el tipo de regalo que los anticuerpos FOXP1. Este trabajo financiado por una beca de la Fundación Wellcome a KCT y una subvención para el proyecto de la Wellcome Trust para SRP (Grant número de referencia 094399/B/10/Z).
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
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24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |