Optagelse elektrisk aktivitet fra Identificerede Neuroner i ubeskadiget Brain af transgene fisk

Summary

I denne video, vil vi vise, hvordan man optager elektriske aktivitet fra identificerede enkeltstoffer neuroner i en hel hjerne forberedelse, som bevarer komplekse neurale kredsløb. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med et fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne forberedelse.

Abstract

Forstå cellens fysiologi af neurale kredsløb, der regulerer kompleks adfærd er stærkt forbedret ved hjælp af modelsystemer, hvor dette arbejde kan udføres i en intakt hjerne forberedelse, hvor neurale kredsløb af CNS forbliver intakt. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med grønt fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne. Fisk har flere populationer af GnRH neuroner og deres funktioner er afhængige af deres placering i hjernen og GnRH gen, de udtrykker ^1.. Vi har fokuseret vores demonstration den GnRH3 neuroner beliggende i de terminale nerver (TN) er forbundet med de olfaktoriske pærer med den intakte hjerne transgene Medaka fisk (figur 1B og C). Undersøgelser tyder på, at Medaka TN-GnRH3 neuroner er neuromodulatory, der handler som en transmitter af oplysninger fra det ydre miljø til det centrale nervesystem; they ikke spille en direkte rolle i reguleringen af hypofyse-gonade-funktioner, som gør den velkendte hypothalamus GnRH1 neuroner ^{2, 3.} Den tonic mønster af spontan handling potentiale affyring af TN-GnRH3 neuroner er en iboende egenskab ^4-6, hyppigheden hvoraf moduleres af visuelle referencer fra artsfæller ² samt neuropeptidet kisspeptin 1 ^5. I denne video, bruger vi en stabil linje af transgen Medaka hvor TN-GnRH3 neuroner udtrykker et transgen indeholdende promoter region Gnrh3 knyttet til øget grønt fluorescerende protein ⁷ for at vise dig, hvordan du identificerer neuroner og overvåge deres elektriske aktivitet i hele hjernen forberedelse ^6..

Protocol

1.. Dissektion af Brains fra Adult Medaka Bedøve voksen mand eller kvinde (figur 1A) ved at nedsænke i 5 ml MS-222 (150 mg / l, pH 7,4), vente et par minutter efter gæller bevægelser er ophørt før decapitating. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of California-Los Angeles. Halshugge fisken i fisk saltvand ved caudale ende af Laag med en saks i et 60-mm diameter petriskål. Transfer fisk hoved til en 35-mm petriskål, h…

Representative Results

Et eksempel på bilaterale klynger af GFP-mærkede TN-GnRH3 neuroner fra det udskårne hjerne Medaka fisk er vist i figurerne 1B og 1C. Hver klynge indeholder omkring 8-10 GnRH neuroner. De spontane neuronale aktiviteter target TN-GnRH3 blev registreret i den nuværende-clamp-tilstand (I = 0) med typiske fyring satser af 0,5-6 Hz. Mønsteret af handling potentiale fyring er typisk en tonic eller slå mønster, med en temmelig regelmæssig interspike interval. Sample spor er vist i <stro…

Discussion

GnRH 3: GFP transgene fisk giver unikke modeller til at studere neurofysiologiske mekanismer bag neuronal integration og regulering i central kontrol af adfærd, der både direkte og indirekte involveret i reproduktion ^{3, 8-10.} En af de betydelige fordele ved denne model er, at mange GnRH3 neuroner udtrykker GFP er tæt på den ventrale overflade af hjernen, der giver mulighed for forholdsvis let adgang til de neuroner elektrofysiologiske optagelse uden at forstyrre neurale kredsløb ^{6, 9, 11, 1…}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus		BX50W (Upright)
Amplifier	Axon Instruments		Axoclamp 200B
A-D converter	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Cooled CCD camera	PCO Computer Optics		Sensicam
Xenon lamp	Sutter Instruments Co.
GFP filter set	Chroma Technologies
Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations		Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software	Axon Instruments		Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage for electrophysiology	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
Recording Chamber Platform	Warner Instrument Corp.		P1
Recording Chamber	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Electrode Puller	Sutter instruments		P87
Filament for electrode puller	Sutter Instruments	FB330B	3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	Microelectrode for recording
Syringe	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline			mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch)			mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch)			mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine