जीएसटी उनकी शुद्धि: पूर्ण लंबाई शुद्ध प्रोटीन उपज वाली एक दो कदम आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम विशिष्ट एक cleavable जीएसटी टैग और एक छोटे से उनकी टैग संयोजन से पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि की अनुमति देता है जो एक अत्यधिक कुशल और लागत प्रभावी छोटे पैमाने प्रोटीन शोधन विधि, प्रदर्शित करता है.
Abstract
इन विट्रो में प्रोटीन की जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए एंजाइमिकी में प्रमुख assays के हित का शुद्ध प्रोटीन की उच्च सांद्रता की जरूरत. प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल दक्षता, सादगी और लागत प्रभावशीलता 1 गठबंधन करना चाहिए. यहाँ, हम एक एन टर्मिनल Glutathione Sepharose टैग (जीएसटी) 2,3 और दोनों जुड़े हुए हैं जो एक सी टर्मिनल 10xHis टैग 4, के आधार पर पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए एक नए छोटे पैमाने पर आत्मीयता शोधन प्रणाली, के रूप में जीएसटी उनकी विधि का वर्णन ब्याज की प्रोटीन के लिए. बाद के निर्माण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 5 Sf9 संक्रमित कोशिकाओं के संक्रमण के लिए, baculoviruses उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जीएसटी शोधन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है, जो एक नहीं बल्कि लंबे टैग (29 केडीए) है. हालांकि, यह प्रोटीन के शारीरिक गुणों प्रभावित हो सकता है. इसलिए, यह बाद में PreScission एंजाइम 6 का उपयोग प्रोटीन बंद cleaved है. , अधिकतम शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए और cleaved जीएसटी को दूर करने के लिए हमेंअपेक्षाकृत छोटे उनकी टैग के आधार पर एक दूसरे के संबंध शुद्धीकरण कदम गयी. महत्वपूर्ण बात है, हमारी तकनीक इसलिए, अपमानित प्रोटीन को हटाने और करने के लिए एक कुशल उपकरण है जो प्रोटीन, के दोनों सिरों flanking दो अलग टैग पर आधारित है, पूर्ण लंबाई प्रोटीन समृद्ध करती है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति ऐसी FPLC के रूप में एक महंगी वाद्य सेटअप, की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, हम गर्मी झटका प्रोटीन दोष और न्यूक्लिक एसिड contaminating खत्म करने का nuclease उपचार दूर करने के लिए 2 MgCl और एटीपी washes शामिल किया. संक्षेप में, flanking दो अलग टैग का संयोजन एन और सी टर्मिनल और टैग में से एक बंद फोड़ना करने की क्षमता, ब्याज की एक उच्च शुद्ध और पूर्ण लंबाई प्रोटीन की वसूली guaranties.
Introduction
पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि जैव रसायन में मौलिक सवालों का पता करने के लिए महत्वपूर्ण है. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी जैसे प्रोटीन शुद्धि का पारंपरिक तरीके क्रमशः ऐसा अपने isoelectric बिंदु और प्रभारी या आकार के रूप में लक्ष्य प्रोटीन के भौतिक गुणों पर निर्भर हैं. उत्तरार्द्ध प्रोटीन विशेषताओं काफी पारंपरिक प्रोटीन शुद्धि रणनीतियों में प्रोटीन contaminating की संभावना बढ़ जाती है, जो प्रोटीन की एक किस्म के द्वारा साझा कर रहे हैं. यह समस्या काफ़ी समय है, जो कई शुद्धि स्तंभों का उपयोग करते हैं, के साथ उन्हें धोखा दिया जा सकता है. इसी समय, बाद क्रोमैटोग्राफी तरीकों महंगा प्रयोगात्मक स्थापना की मांग. अधिकांश मामलों में टैग ब्याज की प्रोटीन के लिए अद्वितीय हो जाएगा के रूप में आत्मीयता टैग शुद्धि दृढ़ता, लक्ष्य विशिष्टता बढ़ जाती है. हाल ही के अध्ययन में, झंडा या हा आत्मीयता शुद्धि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है.
मौजूदा आरईसी के विपरीतएक टैग का उपयोग किया जाता है जिसमें ombinant प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल, हम दो टैग के अद्वितीय संयोजन की स्थापना की. हमारे विधि मात्रा और वांछित प्रोटीन की शुद्धता के बीच एक इष्टतम अनुपात के लिए ब्याज की प्रोटीन की सी टर्मिनस पर एन टर्मिनस और एक उनकी टैग पर एक जीएसटी टैग की फ्यूजन, शामिल है. जीएसटी glutathione Sepharose मोती पर शुद्धि के लिए अत्यधिक कुशल है, जो एक लंबे टैग (29 केडीए), है. इसके अलावा, जीएसटी का उपयोग हमारी विधि 1 की लागत प्रभावशीलता की गारंटी देता है. (केवल दो एमिनो एसिड के अलावा मान्यता अनुक्रम LeuGluValLeuPheGln / GlyPro साथ,) PreScission एंजाइम के साथ जीएसटी बंद फोड़ना संभावना, कई फायदे हैं, उदाहरण के लिए, इस रणनीति allosteric बाधा की वजह से शारीरिक प्रोटीन कार्यों के परिवर्तन से बचा जाता है. अन्य प्रोटीन छोर से जुड़े हुए छोटे उनकी टैग cleaved जीएसटी बंद धोने, साथ ही अपमानित प्रोटीन और अन्य द्वारा प्रोटीन शुद्धता को बढ़ाने के लिए एक दूसरे शोधन चरण में कार्य करता है contaminants. उनकी शुद्धि कदम स्तंभ (टिकट राल) को जीएसटी से जाने के दौरान इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल एक डायलिसिस कदम की आवश्यकता नहीं है. ऐसे शोधन प्रक्रियाओं में आम contaminants गर्मी झटका प्रोटीन (HSP) कर रहे हैं. 2 MgCl और एटीपी के साथ एक ऊष्मायन कदम के अलावा इन प्रदूषणों से हटाने चित्रा (1) की अनुमति देता है.
फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ब्याज का शुद्ध प्रोटीन की उच्च उपज उत्पन्न करने के लिए महंगा उपकरण पर निर्भर है कि आम तकनीकों हैं. हम यहां पेश बैच शुद्धि प्रोटोकॉल, इसके विपरीत, मार्गदर्शन है और एक महंगी वाद्य सेटअप की आवश्यकता नहीं है. प्रोटीन का एक उच्च उपज प्रोटोकॉल को स्केलिंग द्वारा पहुंचा जा सकता है. इसी समय, बैच शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ, क्षालन मात्रा FPLC या HPLC साथ नहीं दिया जाता है, जो प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में समायोजित किया जा सकता है.
ntent "> इसके अलावा, बैच जीएसटी उनकी शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ, ~ 10-300 केडीए के एक आकार सीमा के साथ प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है. सबसे बड़ा लाभ एक ही समय में कई प्रोटीन शुद्ध कर सकते हैं कि इस तथ्य से दिया जाता है उदाहरण के लिए, एक जंगली प्रकार और उसके उत्परिवर्ती प्रोटीन दोनों. प्रस्तुत प्रोटोकॉल की सफलता केवल ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर और घुलनशीलता पर निर्भर करता है.Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत जीएसटी उनकी शुद्धि प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के आकार के एक विस्तृत रेंज की शुद्धि के लिए उपयुक्त है: हम सफलतापूर्वक ली RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), और एक अस्थिर उच्च आणविक भार प्रोटीन की श?…
Acknowledgements
हम पद्धति के विकास के लिए प्रमुख विचार विमर्श के लिए ऐनी-Marie डायोन-कोटे धन्यवाद. जे और आरबी FQNRT डॉक्टरेट विद्वानों हैं, एम. -एम.जी. एक Vanier CIHR विद्वान है, और जे-YM एक FRSQ वरिष्ठ शोधकर्ता है. इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और जे के लिए इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से धन के द्वारा समर्थित किया गया. एम.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
References
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