GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков
Summary
В настоящем протоколе, мы демонстрируем высокоэффективную и экономичную мелкого способа очистки белка, что позволяет очистку рекомбинантных белков однозначно объединения расщепляемую GST-тег и небольшой His-тег.
Abstract
Основные анализы в энзимологии для биохимического характеризации белков в пробирке требуют высоких концентраций очищенного белка, представляющего интерес. Протоколы очистки белков должен сочетать в себе эффективность, простоту и эффективность затрат 1. Здесь мы опишем GST-его метод в качестве нового малого аффинной очистки системы рекомбинантных белков, основанный на N-концевой глутатион Сефарозе Tag (GST) 2,3 и С-концевые 10xHis метки 4, которые оба плавленого к белку интерес. Последний конструкция используется для генерации бакуловирусов, для заражения инфицированных клеток Sf9 для экспрессии белка 5. НДС является довольно долго тег (29 кДа), который служит для обеспечения эффективности очистки. Тем не менее, это может влиять на физиологические свойства белка. Таким образом, он впоследствии отщепляется белка с использованием фермента предразрывных 6. Для того, чтобы обеспечить максимальную чистоту и снять расщепленный GST, мыдобавили вторую стадию очистки на основе сродства сравнительно небольшой His-Tag. Важно отметить, что наша методика основана на двух различных меток, фланкирующих два конца белка, который является эффективным средством для удаления деградированных белков и, следовательно, обогащает полноразмерные белки. Метод, представленный здесь, не требует дорогостоящего инструментального настройки, такие как FPLC. Кроме того, мы включили MgCl 2 и АТФ вымывания белка теплового шока примесей и нуклеазы лечение отменить загрязняющих нуклеиновых кислот. Таким образом, сочетание двух разных тегов фланговые N-и С-концевой и способность расщеплять от одного из тегов, гарантирует восстановление с высокой степенью чистоты и полноразмерного белка интереса.
Introduction
Очистку рекомбинантных белков имеет решающее значение для решения фундаментальных вопросов биохимии. Обычные способы очистки белка, такие как ионообменной хроматографии и гель-проникающей хроматографии полагаться на физические свойства белка-мишени, такие как его изоэлектрической точке и заряда или размера, соответственно. Последние характеристики белка являются общими для различных белков, что значительно повышает шансы на примесные белки в обычных стратегий очистки белков. Эта проблема может быть преодолена с использованием нескольких столбцов очистки, которая отнимает много времени. В то же время, последние методы хроматографии требуют дорогой экспериментальную установку. Очистка Affinity-тег сильно возрастает целевой специфичностью, как и в большинстве случаев метка будет уникальным для интересующего белка. В недавних исследованиях, Флаг-или HA-аффинной очистки широко используется.
В отличие от существующих рекombinant протоколы очистки белков, в которых используются одиночные теги, мы создали уникальную комбинацию двух тегов. Наш метод предполагает слияние с GST-тега на N-конце и His-тэга на С-конце белка интереса, для оптимального соотношения между количеством и чистотой целевого белка. GST длинный тег (29 кДа), который является высокоэффективным для очистки на гранулах сефарозы глутатиона. Кроме того, с помощью GST гарантирует экономическую эффективность нашего метода 1. Возможность для расщепления от GST с ферментом PreScission (с последовательность узнавания LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, в результате добавления всего двух аминокислот) имеет много преимуществ, например, эта стратегия позволяет избежать изменения физиологических функций белка из-за аллостерической помех. Небольшой His-метка, слитый с другим белком конечности служит в качестве второго шага очистки увеличить чистоту белка путем смывания расщепленный GST, а также деградируют белки и другие загрязняющие вещества. Кроме того, протокол не требует стадии диализа при переключении из GST с His-стадии очистки колонку (TALON смолы). Общие загрязняющих веществ в таких процессах очистки являются Белки теплового шока (HSP). Добавление инкубационного ногу с MgCl 2 и АТФ допускает удаление этих загрязнений (рис. 1).
Быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) общие методы, которые зависят от дорогих приборов для генерации высокий выход очищенного белка. Очистка протокола пакетного мы представляем здесь, в отличие, является ручной и не требует дорогостоящего инструментального установки. Высокий выход белка может быть достигнуто путем расширения протокола. В то же время, с протоколом пакетной очистки, объем элюирования можно регулировать с целью повышения концентрации белка, который не дано с FPLC или ВЭЖХ.
ntent "> Кроме того, с GST-Его протокол очистки пакетного белки с размером-диапазоне ~ 10-300 кДа может быть очищен. Одна из самых больших преимуществ задается на то, что можно очистить несколько белков в то же время Например, как дикого типа и его мутантный белок. Успех представленной протокола зависит исключительно от уровня экспрессии и растворимости белка, представляющего интерес.Protocol
Representative Results
Discussion
GST-Его очистка протокол, представленные здесь, пригодны для очистки в широком диапазоне размеров рекомбинантных белков: Мы успешно очищен Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) и нестабильную высокой молекулярной массой белок Лейшмания infantum: Ли BRCA2 (125kDa) 6,9. Кроме того, белки, очищен…
Acknowledgements
Мы благодарим Анн-Мари Dion-Côte для обсуждений, в развитии метода. JK и РБ являются FQNRT докторские ученые, М.-MG является ученым Ванье CIHR, Дж.-YM является старший научный сотрудник FRSQ. Эта работа была поддержана за счет средств естественных наук и инженерного исследовательского совета в JY. М.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
References
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
- Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
- Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
- Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
- Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
- Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
- Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
- Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
- Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
