GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity
Summary
Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.
Abstract
In vitro protein biyokimyasal karakterizasyonu için in Enzymology anahtar tahliller, ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Protein saflaştırma protokolleri etkinlik, basitlik ve maliyet etkinliğini 1. birleştirmek gerekir. Burada, bir N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) ve her ikisi de 2,3-kaynaşmış, bir C-terminal 10xHis etiketi 4 dayanan rekombinant protein için yeni bir küçük ölçekli bir afinite arıtma sistemi gibi GST-His yöntemi tarif ilgilenilen proteine. İkinci yapı, protein ekspresyonu için Sf9 5 enfekte olmuş hücrelerin enfeksiyonu için, baculovirüsler oluşturmak için kullanılır. KDV arıtma verimliliği sağlamak için hizmet veren, oldukça uzun bir etiket (29 kDa) 'dir. Bununla birlikte, proteinin fizyolojik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu daha sonra 6 PreScisson enzim kullanılarak protein kesilir. , En fazla saflık sağlamak ve bölünmüş GST çıkarmak için, biznispeten küçük bir His-Tag göre ikinci bir afinite saflaştırma adımı ilave edildi. Önemli olarak, bizim teknik bu nedenle, bozulmuş proteinlerin çıkması ve etkili bir araçtır, proteinin, iki ucunu yan iki farklı etiketler dayanan, tam uzunluklu proteinlerin zenginleştirir. Burada sunulan yöntem, FPLC gibi pahalı bir enstrümantal kurulum, gerektirmez. Ayrıca, ısı şoku proteini kirleri ve nükleik asitler kontamine kaldırmaya nukleaz tedavisi kaldırmak için MgCl2 ve ATP yıkar dahil. Özet olarak, yandan kuşatan iki farklı etiketler kombinasyonu N-ve C-terminal ve etiketler biri kapalı parçalama yeteneği, ilgi konusu bir yüksek derecede arıtılmış ve tam-boy proteinin kurtarma garanti eder.
Introduction
Rekombinant proteinlerin saflaştırılması biyokimya temel soruları için önemlidir. Iyon değişim kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi gibi protein saflaştırma geleneksel yollar olduğu, örneğin izoelektrik noktası ve ücret ya da boyutu gibi hedef proteinin fiziksel özelliklerine dayanır. Bu ikinci protein özellikleri önemli ölçüde geleneksel protein saflaştırma stratejilerinde kirletici proteinleri şansını arttırır proteinlerin çeşitli tarafından paylaşılır. Bu sorun, zaman alıcı, birden çok arıtma sütun kullanımı ile engellenebilecektir. Aynı zamanda, ikinci kromatografi yöntemler pahalı deney düzeneği gerektirir. Olguların çoğunda etiket ilgi protein benzersiz olacak gibi afinite etiketi arıtma güçlü, hedef-özgüllük artar. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, Flag-ya da HA-afinite saflaştırma yaygın olarak kullanılmaktadır.
Mevcut rec aksineTek etiketleri kullanıldığı ombinant protein saflaştırma protokolleri, iki etiketlerin benzersiz bir bileşimini kurulmuştur. Önerilen yöntem, miktar ve istenen proteinin saflığı arasında optimum bir oranı için, ilgi konusu proteinin C-terminalinde N-terminalinde bir His-tag, bir GST-füzyon etiketinin içerir. GST glutatiyon Sefaroz taneleri üzerinde saflaştırma için yüksek verimli bir uzun etiketi (29 kDa) 'dir. Ayrıca, KDV kullanarak bizim yöntem 1 maliyet etkinliğini garanti. (Sadece iki amino asit ilavesi ile sonuçlanan tanıma sekansı LeuGluValLeuPheGln / GlyPro ile) PreScisson enzimi ile GST kapalı yarmak için bir olasılık, bir çok avantajı vardır, örneğin, bu strateji allosterik bir engel nedeniyle fizyolojik protein fonksiyonlarının değişiklikler önler. Diğer protein ucuna kaynaşmış His-tag, küçük bölünmüş GST yıkandıktan, hem de bozulmuş proteinlerin ve diğer protein saflığını daha da arttırmak için ikinci bir arıtma adımında karşılık vermektedir kirleticiler. His-saflaştırma adımı kolonu (TALON reçinesi) için GST geçiş Ek olarak, iletişim kuralı, bir diyaliz adımı gerektirmez. Bu tür saflaştırma işlemlerinde yaygın kirletici maddeler ısı şok proteinlerinin (HSP) 'dir. MgCI2 ve ATP ile bir kuluçkalama adımının eklenmesi bu kirleticilerin çıkarılması (Şekil 1) sağlar.
Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek verim elde etmek için pahalı enstrümantasyon bağlıdır sıradan yöntemlerdir. Burada mevcut toplu arıtma protokolü, aksine, manuel ve pahalı bir enstrümantal kurulum gerektirmez. Protein yüksek verim protokolünü ölçeklendirme ulaşılabilir. Aynı zamanda, toplu arıtma protokolü ile, elüsyon hacmi FPLC ve HPLC ile verilmezse protein konsantrasyonu arttırmak için ayarlanabilir.
ntent "> Aynı zamanda, toplu GST-His arıtma protokolü ile, ~ 10-300 kDa bir boyut aralığı ile proteinler saflaştırılabilir. en büyük avantajlarından biri, aynı anda birkaç proteinleri saflaştırmak gerçeği ile verilir Örneğin, bir vahşi tip ve mutant protein hem de. sunulan protokol başarı sadece, ilgi konusu proteinin ekspresyon seviyesi ve çözünürlüğüne bağlıdır.Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan GST-His rekombinant proteinlerin saflaştırma protokolü boyutları geniş bir aralığının saflaştırılması için uygundur: başarıyla Li Rad51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) ve dengesiz yüksek molekül ağırlıklı protein saflaştırılmış Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Ayrıca, bu protokol ile saflaştırılmış proteinler 6 biyokimyasal aktif edildi. Bu yöntemin başarısı, sadece arzu edilen protein ekspresyon, çözünür…
Acknowledgements
Biz yönteminin gelişmesine yol açan tartışmalar için Anne-Marie Dion-Cote teşekkür ederim. JK ve RB FQNRT doktora alimler vardır, M.-MG Vanier CIHR âlimi, ve J.-YM bir FRSQ kıdemli araştırmacıdır. Bu çalışma, Fen Bilimleri ve JY Mühendislik Araştırma Konseyi fonları tarafından desteklenmiştir. M.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
References
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
- Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
- Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
- Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
- Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
- Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
- Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
- Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
- Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
