Развитие, расширение и<em> В естественных условиях</em> Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
Summary
Этот протокол описывает развитие, расширение, а в естественных изображений NK клетки, полученные из ЭСК и ИПСК.
Abstract
Мы представляем метод для получения естественных киллеров (NK) клетки из недифференцированных ЭСК и ИПСК с помощью кормушки-свободный подход. Этот способ приводит к высокому уровню НК-клеток после 4 недель и культуры могут пройти дальше 2-журнала расширения с искусственным антигенпрезентирующих клетках. ЭСК и ИПСК полученных НК-клеток разработаны в этой системе есть зрелая фенотипа и функции. Производство большого числа генетически модифицируемых клетки NK применяется как основное механистической, а также противоопухолевые исследований. Экспрессия люциферазы светляков в чЭСК НК-клеток позволяет неинвазивным подходом следовать НК приживления ячейки, распределение и функции. Мы также описываем двойного изображения схеме, что позволяет отдельным мониторинг двух различных клеточных популяций, чтобы более отчетливо характеризуют их взаимодействия в естественных условиях. Этот способ вывода, расширения и двойного прижизненного изображения обеспечивает надежный подход к производству НК-клеток и их оценAtion которые необходимо улучшить текущую NK клетки приемных терапии.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) недифференцированных плюрипотентных клеток, способных неограниченное самообновлению и мульти-линии дифференциации. ЭСК были успешно дифференцировались в зрелые и функциональные подмножества каждый слой зародышей, включая клетки кроветворной системы 1-3. Природных киллеров (NK) клетки лимфоцитов врожденной иммунной системы, которые могут быть получены из ЭСК путем формирования эмбриональных телец (ЕВ) 4,5 или совместное культивирование с стромальных клеточных линий 1,2,6-8. NK-клетки обладают антивирусной и противоопухолевой возможности и имеют потенциал, чтобы быть эффективным против широкого спектра злокачественных опухолей, так как они не требуют предварительного антигенной стимуляции выполнять свои эффекторные функции. Таким образом, чЭСК NK-клетки являются привлекательными источник клеток для иммунотерапии. Кроме того, при выводе NK клеток из ЭСК обеспечивает генетически поддаются системы для изучения нормального развития <EM> в пробирке.
Потому что они обеспечивают генетически послушный системы, чЭСК НК-клеток может быть экспериментально изменен, чтобы выразить флуоресцентные и биолюминесцентными журналистам обеспечения оптимальной моделью для изучения НК клетки эффекторных функций в пробирке и в естественных условиях. чЭСК НК-клетки обладают активностью против ряда целей, включая ВИЧ 9, лейкоз (К562) и другие типы рака 7,8. Тем не менее, способность эффективно получать достаточно NK-клеток, способных к лечению пациентов остается важным барьером для клинического перевода и, в меньшей степени, ограничение на обширные доклинические в естественных условиях исследования НК развитие клеток и противораковые функции. Здесь мы используем подход спина EB для получения кроветворных предшественников из ЭСК 4,5,10. После 11 дней спина ЭТ передаются НК клеточной культуры с или без питателей течение 28 дней. Через 4 недели в НК среду для культивирования клеток, NK клетки Transferred в совместной культуре с К562 модифицированный выразить мембраной интерлейкина 21 (IL-21), которые служат в качестве искусственного антигенпрезентирующих клетках (aAPCs). Адаптация протокола для расширения периферической крови NK клеток с использованием этих искусственных БТР 11,12, мы можем расширить НК-клеток 2-журналы, сохраняя зрелый фенотип и цитотоксических возможностями.
Этот процесс развития и расширения обеспечивает достаточную чЭСК NK клеток для обширных в естественных характеристик. Для прижизненного исследования, мы имеем возможность неинвазивного мониторинга долгосрочного приживления и кинетики впрыском люциферазы светляков, выражающие (Fluc +), чЭСК NK клеток с использованием биолюминесценции изображений. Кроме того, мы в состоянии следовать НК взаимодействия клетки с клетками опухоли используя двойной, биолюминесцентными или флуоресцентные изображения схемы. В более раннем исследовании нашей группы использовали биолюминесценции изображений в противоопухолевой примером для подражания прогрессирования опухоли и НКУArance из Fluc К562 + клеток в живом 7. Теперь, на основе технического наших ЭСК, чтобы выразить люциферазы светляков 13,14 мы можем следовать биораспределении и торговли НК-клеток К562 опухолевые клетки, которые выражают в последнее время характеризуется флуоресцентный белок, turboFP650 15. Мы выбрали это двойная система репортера, чтобы одновременно следить за две клеточные популяции в естественных условиях (рис. 1). Наиболее модели с двумя изображениями были двойного люциферазы системы, но эти системы могут быть технически сложной задачей из-за требования к поставке коэлентеразина, подложка необходим для экспрессии наиболее Renilla и Gaussia люциферазы репортеров 16-18. Флуоресцентные журналистам позволили легкий контроль многих клеточных линий и конструкций в лабораторных условиях, но имел ограниченный успех в естественных изображений из-за перекрытия между тканью и мехом флуоресценции и спектры излучения многих сотрудничестваmmonly использовали флуоресцентные журналистам в том числе GFP, DsRed и TdTomato 15,19. Это беспокойство способствовал освоению дальнего красного флуоресцентного белка, которые позволяют лучше пенетрантности ткани и более высокой удельной сигнала по сравнению с фоном 15,19. TurboFP650, флуоресцентный белок показано в этой системе, далеко-красные изменилось, и преодолевает многие вопросы, связанные с изображениями флуоресцентных белков в живых животных.
Этот метод для развития и расширения NK клетки, полученные из ЭСК позволила нам для дальнейшей характеризации чЭСК НК-клеток в пробирке и в естественных, которая необходима, чтобы лучше понять функции NK клеток и клинически значимое улучшение текущей клетки NK приемных терапии. Это также поддаются вывода и расширения ИПСК полученных НК-клеток. Двойной флуоресцентный и биолюминесцентного изображения схема может широко применяться в системах, отличных от противоопухолевой модели мы показали здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
ЭСК являются идеальной платформой для изучения разных типах клеток и удерживать значительный потенциал для клинического перевода. Мы используем определены, спина EB дифференцировать подход к ЭСК / ИПСК в гемопоэтические клетки-предшественники. Подход спин EB дал последовательный выво?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Мелинда Hexum для начала протокол EB спина в нашей лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить других членов лаборатории, в том числе Laura E. Bendzick, Майкл леплю, и Женя Ni за техническую помощь в этой работе. Авторы также хотели бы поблагодарить Брэда Тейлора в суппорт Life Sciences за его экспертные технические консультации.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
Referências
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
