Utvikling, utvidelse, og<em> In vivo</em> Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)
Summary
Denne protokollen beskriver utviklingen, utvidelser og in vivo avbildning av NK-celler avledet fra hESCs og iPSCs.
Abstract
Vi presenterer en metode for å utlede natural killer (NK) celler fra udifferensiert hESCs og iPSCs ved hjelp av en mater-fri tilnærming. Denne fremgangsmåte gir opphav til høye nivåer av NK-celler etter 4 ukers kultur og kan gjennomgå ytterligere to-log utvidelse med kunstige antigenpresenterende celler. hESC-og iPSC-derived NK-celler utviklet i dette systemet har en moden fenotype og funksjon. Fremstillingen av et stort antall genetisk modifiserbare NK-celler er anvendelig for både enkle mekanistiske så vel som anti-tumor-studier. Ekspresjon av ildflue luciferase i hESC-avledede NK-celler tillater en ikke-invasiv metode for å følge NK-celle innpodingen, distribusjon og funksjon. Vi beskriver også en dual avbildning-ordning som gjør det mulig separat overvåking av to forskjellige cellepopulasjoner til mer utpreget karakterisere deres interaksjoner in vivo. Denne metoden for avledning, ekspansjon, og dual in vivo avbildning gir en pålitelig metode for å fremstille NK-celler og deres evaluasjon som er nødvendig for å forbedre dagens NK-celle adoptive terapi.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er udifferensierte, pluripotente celler i stand til ubegrenset selvfornyelse og multi-avstamning differensiering. hESCs har blitt differensiert i modne og funksjonelle undergrupper av hver bakterie lag, herunder celler av hematopoietisk system 1-3. Natural killer (NK) celler er lymfocytter i det medfødte immunsystemet som kan utledes fra hESCs ved dannelsen av embryoid organer (EBS) 4,5 eller co-kultur med stromal cellelinjer 1,2,6-8. NK-celler har anti-viral og anti-tumor egenskaper, og har potensial for å være effektive mot et bredt spekter av maligniteter, ettersom de ikke krever forutgående antigenstimulering å utføre sine effektorfunksjoner. Dermed hESC-avledet NK-celler er en attraktiv kilde til celler for immunterapi. I tillegg gir avledning av NK-celler fra hESCs en genetisk mottagelig for å studere normal utvikling <em> in vitro.
Fordi de gir en genetisk medgjørlig system, kan hESC-avledet NK-celler bli eksperimentelt modifisert for å uttrykke og fluorescerende bioluminescent reportere som gir en optimal modell for å studere NK-celle effektor funksjoner in vitro og in vivo. hESC avledede, NK-celler innehar aktivitet mot et spekter av mål inkludert 9 HIV, leukemi (K562) og andre typer kreft 7,8. Imidlertid er evnen til effektivt utlede nok NK-celler i stand til å behandle pasienter forblir en viktig hindring for klinisk oversettelse og er, i mindre grad, en begrensning for utstrakt prekliniske in vivo studier av NK-celle utviklingen og anti-kreft-funksjoner. Her bruker vi en spin EB tilnærming til utlede blodkreft stamceller fra hESCs 4,5,10. Etter 11 dager spin EBS overføres til NK cellekultur med eller uten feeders i 28 dager. Etter 4 uker i NK celle kulturmedium, NK-celler er transferred til ko-kulturen med K562-celler til å uttrykke modifiserte membran-bundet interleukin 21 (IL-21), som tjener som kunstige antigen-presenterende celler (aAPCs). Tilpasning en protokoll for utvidelse av perifert blod NK-celler ved hjelp av disse kunstige APC 11,12, er vi i stand til å utvide NK-celler 2-logger og samtidig beholde en moden fenotype og cytotoksiske evner.
Denne prosessen med utvikling og ekspansjon gir tilstrekkelige hESC-avledet NK-celler for omfattende in vivo karakterisering. For in vivo studier, er vi i stand til ikke-invasiv overvåke lang sikt engraftment og kinetikk av injisert ildflue luciferase uttrykke (Fluc +), hESC-avledet NK-celler ved hjelp Bioluminescens bildebehandling. Videre er vi i stand til å følge NK celle interaksjoner med kreftceller ved hjelp av en dobbel, selvlysende eller fluoriserende bildebehandling ordningen. En tidligere studie av vår gruppe brukte Bioluminescens bildebehandling i en anti-tumor modell å følge tumor progresjon og cleArance av svingninger + K562 celler in vivo 7. Nå, ved å konstruere våre hESCs å uttrykke ildflue luciferase 13,14 kan vi følge fordelingen og trafficking av NK-celler til K562 kreftceller som uttrykker den nylig preget fluorescerende protein, turboFP650 15. Vi har valgt denne dual reporter system for å følge samtidig de to cellepopulasjoner in vivo (figur 1). Mest dual bildebehandling modeller har vært dual-luciferase systemer, men disse systemene kan være teknisk utfordrende på grunn av levering krav coelenterazine, underlaget kreves for uttrykk for de fleste Renilla og Gaussia luciferase reportere 16-18. Fluorescerende reportere har tillatt enkel overvåking av mange cellelinjer og konstruerer in vitro, men har hatt begrenset suksess for in vivo avbildning på grunn av overlappingen mellom vev og pels autofluorescens og emisjonsspektra av mange commonly brukt fluorescerende reportere inkludert GFP, DsRed, og TdTomato 15,19. Denne bekymringen har oppmuntret utviklingen av langt-røde fluoriserende proteiner, som gir mulighet for bedre vev penetrans og høyere spesifikk signal i forhold til bakgrunnen 15,19. TurboFP650, den fluorescerende protein vist i dette systemet, er langt-rød forskjøvet og overvinner mange av de problemene som er involvert med bildebehandling fluorescerende proteiner i levende dyr.
Denne fremgangsmåte for å utvikle og bygge NK-celler avledet fra hESCs har tillatt oss å ytterligere karakterisere hESC-avledet NK-celler in vitro og in vivo, noe som er nødvendig for å få en bedre forståelse NK-celle-funksjon og klinisk viktig for å forbedre dagens NK-celle adoptive terapi. Det er også mottagelig for avledning og utvidelse av iPSC-avledede NK-celler. Den doble fluorescerende og bioluminescent avbildning ordningen er bredt anvendelig på andre systemer enn det anti-tumor-modellen har vi vist her.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs er en ideell plattform for å studere ulike celletyper og holder bemerkelsesverdig potensial for klinisk oversettelse. Vi bruker en definert, spin EB tilnærming å skille hESC / iPSCs til blodkreft stamceller. Spin EB Innsatsen har gitt konsistent avledning av blodkreft stamceller og differensiering til NK-celler, men likevel, variasjon fortsatt eksisterer i differensiering effektivitet på tvers av cellelinjer og kan trenge å bli endret for generering av andre blodkreft celle linjene. Mens sammenlignbare result…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Melinda Hexum for initiering av spinn EB-protokollen innen vårt laboratorium. Vi ønsker å takke andre medlemmer av lab, inkludert Laura E. Bendzick, Michael Lepley, og Zhenya Ni for deres hjelp i forbindelse med dette arbeidet. Forfatterne vil også gjerne takke Brad Taylor på Caliper Life Sciences for hans ekspert teknisk rådgivning.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
Referências
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
