На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию
Summary
Методы, чтобы рассекать механизмы, лежащие в основе секреции ВИЧ-1 Неф в экзосомах описаны. Конкретные короткие пептиды, полученные из белка Nef и трансфекции были использованы, чтобы определить структуру, функции и связывающих партнеров секреции региона Модификация Nef автора. Эти процедуры имеют общий интерес во многих механистических исследований.
Abstract
Конкретные короткие пептиды, полученные из мотивов, найденных в полноразмерных белков, в данном случае ВИЧ-1 Nef, не только сохраняют свою биологическую функцию, но также может конкурентно ингибируют функцию полноразмерного белка. Набор 20 Nef сканирования пептиды, 20 аминокислот в длину с каждого перекрытие 10 аминокислот его сосед, были использованы для выявления мотивов в Nef, ответственным за его индукции апоптоза. Пептиды, содержащие эти апоптоза мотивы индуцированный апоптоз на уровне, сопоставимом с полной длиной Nef белка. Второй пептид, полученный из области секреции модификации (СМР) из Nef, сохранили способность взаимодействовать с клеточных белков, участвующих в секреции Nef в экзосомы (exNef). Этот пептид SMRwt был использован в качестве "приманки" белок в коиммунопреципитации экспериментов по выделению клеточных белков, которые специфически связываются с SMR мотив Nef в. Ингибирование белка трансфекции и антитело, используемое для физического нарушать взаимодействие ставкуWEEN Nef и mortalin, один из изолированного SMR-связывающих белков, и эффект измеряли с помощью флуоресцентного анализа на основе секреции exNef. Способность пептидов SMRwt к вытеснять полнометражный Nef для клеточных белков, которые связываются SMR мотив, сделать его первым ингибитором секреции exNef. Таким образом, при использовании методов, описанных здесь, в которых используются уникальные свойства конкретного короткие пептиды, полученные из мотивов, найденных в полноразмерных белков, можно ускорить идентификации функциональных мотивов в белках и разработка на основе пептидов ингибиторы патогенных функций.
Introduction
С появлением антиретровирусной терапии, эпидемия СПИДа в западном мире было замедлено, но не урезаны, а распространение ВИЧ по-прежнему является основным бременем для здравоохранения во всем мире. За исключением минимально эффективное RV144 испытание Thai, вакцины против ВИЧ до сих пор показано неспособностью защитить от инфекции. Таким образом, исследования по дополнительным, потенциальные терапевтические цели по-прежнему оправдано.
Наряду с CD4 Т-клеток, персистирующая генерализованная активация иммунной системы является отличительной чертой ВИЧ-инфекции. Эта хроническая активация иммунной системы (CIA) приводит к увеличению обновления клеток, активированных и дифференцированные субпопуляциями, сотовая истощение и старение, и убийство Т-клеток и В-клеток с помощью активации индуцированных гибель клеток (AICD) 1,2,3, и она хорошо известна как одна из самых сильных предикторов прогрессирования заболевания 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Тем не менее, механизмы, лежащие ЦРУ и CD4Т-клеток при ВИЧ-инфекции еще предстоит полностью не выяснены.
Данные, полученные в нашей лаборатории и другие привели нас к модели прогрессирования заболевания (рис. 1), где белок ВИЧ Неф (негативный регуляторный фактор) индуцирует его секреции в экзосомах от ВИЧ-1 инфицированных клеток 13,14. Эти Nef содержащих экзосомы (exNef) индуцируют апоптоз в ряде клеточных линий, включая неинфицированные CD4 Т-клеток 15,16. Кроме того, в моноциты / макрофаги exNef изменяет экспрессию генов узоры, например, выражение цитокинов, и, кажется, вызывает состояние иммунной активации незапланированное. Этот данных свидетельствует о важной роли exNef в ЦРУ и CD4 Т-клеток.
Понимание механизмов, лежащих в основе способности Nef, чтобы манипулировать экзосомальных пути торговли будут полезны в технике новых ингибиторов секреции exNef. Ингибирования секреции exNef должна уменьшать CD4 Т-лимфоцитови ЦРУ, что диск с ВИЧ / СПИДом патогенез.
Чтобы собрать доказательства того, что привело к нашей модели по профилактике ВИЧ / СПИД прогрессирования заболевания и последующие данные, которые построены на этой модели, мы разработали ряд новых реагентов и методик, которые позволили нам проанализировать генетику exNef секреции, и начинают определять клеточные белки участвуют. В начальной работы, мы обнаружили, что Nef белок индуцирует апоптоз в клетках наблюдателем и освобождается от внеклеточно Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки 15. Пептиды, полученные из SDF-1α (стромальных клеток, полученных Фактор-1, с альтернативными альфа сплайсинг) было показано ранее, сохранить большую часть обязательных и сигнальную активность полноразмерной молекулы 17. Мы предположили, что пептиды Nef может сохранить некоторые апоптотической активности полный белок, и что эти пептиды обязательно содержать Nef апоптоза домена (ов). Чтобы определить эти пептиды, и, следовательно, Нефапоптоза домен (ы), мы получили набор из 20 ВИЧ-1 Неф сканирования пептидов из NIH исследований СПИДа и программы Ссылки реагента. Эти 20-ак пептидов, каждое перекрытие 10 аминокислот его сосед, именуются по числу их последней аминокислоты, то есть N20 пролетов Nef аминокислот 1-20, N30 пролетов Nef аминокислоты 11-30, и т.д. 16. Мы обнаружили, что воздействие на Т-клетки внеклеточного со специфическими пептидами перекрытия двух различных 10-AA доменов в полнометражном Nef белок индуцирует апоптоз в этих клетках. Последующий анализ этих Nef-производных пептидов апоптоза показало их способность физически взаимодействовать с рецептором хемокинов CXCR4 на поверхности Т-клетки, с кинетику связывания, которые позволили эти пептиды конкурентно ингибировать связывание между CXCR4 и его природным лигандом SDF-1α. Наконец, взаимодействие Nef полученных апоптоза пептидов с CXCR4 был найден, чтобы вызвать стрессовую реакцию в этих Т-клеток приводит к апоптозу. Эти данные позволили нам QUICKly карту Неф в функциональных областей; процесс, который был бы гораздо больше времени с использованием стандартных ДНК мутагенных методы, такие как аланин сканирующий мутагенез. Он также показал, что эти короткие Nef-пептидов сохранили биологическую функцию апоптоза доменов в полноразмерного белка.
Выявив роль внеклеточной Неф, т.е. апоптоз Т-клеток, мы стремились лучше понять, как Неф был секретируется клетками. Используя серию мутировал конструкций Неф, мы сопоставили высоко консервативных мотивов Nef белка в N-концевых участков как ВИЧ, так Неф, и его макаки резус эквивалентной SIV Mac (Simian Вирус иммунодефицита) Неф, которые имеют решающее значение для секреции exNef 13. Один из этих мотивов, регион секреции Модификация (СМР; 66VGFPV70), было особенно важным, как аланин замены любого из пяти аминокислот, либо значительно сокращены или отменены exNef секреции. Когда доставлены в клетки с помощью C активность мотиваhariot белка поставки реагента, пептид, содержащий SMR прикреплена к последовательности FLAG пептид (SMRwt) было обнаружено, ингибирует секрецию exNef с обеих Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки 18. На основе нашего предыдущего опыта с пептидами, мы решили использовать этот пептид выяснить молекул и механизмов, лежащих в основе роли Nef SMR в секреции exNef.
Использование SMRwt пептида, как наш "приманки белка», мы совместно иммунопреципитировало сотовой связывающих партнеров МСП из неинфицированных Т-клеточных лизатов 18. Последовательность пептида FLAG предоставил удобную ручку для захвата SMRwt пептида с использованием анти-FLAG смоле. Наш предыдущий вывод, что один валин на аланин в пептидной SMRwt было достаточно для его отмене ингибирования секреции exNef определили удобно, весьма специфический контрольный пептид (SMRmut), которые мы использовали, чтобы исключить совместное иммуноосажденного белки не специфичны для SMR. Использование пептид с секpecific область интересов, а не полноразмерного белка позволило нам обойти скрининг десятков клеточных факторов, которые связываются с другими доменами в Неф 19.
Как только мы определили SMR-связывающих партнеров, следующим логическим шагом было показать, что выявленные сотовой связывающие партнеры важны для биологической функции 18. Стандартной процедурой для достижения этой цели является нокдаун белка использованием белок-мишень конкретных микроРНК или миРНК, а впоследствии анализ влияния на биологические функции. Мы провели микроРНК нокдаун, которое ингибирует трансляцию мРНК-мишени, снижение производства этой цели, в данном случае SMR-связывающий белок. Это уменьшение целевого белка косвенное воздействие, и, возможно, имеет задержку влияние на биологическую функцию целевой белок играет роль дюйма Следовательно, мы также использовали менее распространенный метод ингибирование антителами, чтобы определить, непосредственно нарушения деятельностицелевого белка уменьшает или устраняет биологической функции. В этой процедуре антител, полученных против белка-мишени трансфицируют в клетку использованием Колесница реагентов и взаимодействуют непосредственно с белком-мишенью, либо изолирующий его от места его функции или блокирования его соответствующим связывающим доменом. Ингибирование целевого белка через эту процедуру непосредственно нарушает его функции, и могут дополнять процедуры нокдауна РНК дальнейшим что подтверждает важность целевого белка в биологической функции.
В то время как Колесница реагент является эффективным при доставке пептидов и белков в клетки, этот процесс занимает много времени и ограничивает типа экспериментов, например продолжительного или повторяющегося воздействия и в естественных условиях исследования на животных, которые могут быть выполнены. Следовательно, мы добавили клеточной проникающих пептидов (CPP) последовательность SMRwt пептид (SMRwt-CPP) 18, генерируя пептид, который может быть воспринята клеткой пассивноиз культуральной среды. Эта версия была так эффективна, как бывший в подавлении секреции exNef.
Данные, полученные в этих опубликованных экспериментов демонстрируют способность небольшие пептиды, содержащие специфические функциональные мотивы противодействовать функцию полноразмерного белка посредством конкурентного ингибирования, и изолировать белками, которые связывают эти мотивы. Можно было бы ожидать, что эти методы должны быть полезны во многих экспериментальных протоколов. Они также должны быть эффективными в инженерных романа пептидные ингибиторы многих клеточных процессах; функция, которая может быть расширена путем связывания с CPP последовательностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание механизмов, лежащих в основе способности Nef, чтобы манипулировать экзосомальных пути торговли будут полезны в технике новых ингибиторов секреции exNef. Ингибирования секреции exNef должна уменьшать CD4 Т-клеток и ЦРУ, что диск с ВИЧ / СПИДом патогенез. Для достижения этой цели, мы ра…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH / NIGMS / MBRS (грант 58268), NIH / NCRR / RCMI (грант G12-RR03034), Грузия исследований Альянс грантов GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA грант F31AI091484, Эмори CFAR грант P30 A1050409. Это исследование было проведено в объекта, построенного при поддержке исследовательских установок Улучшение грант № C06 RR18386 от NIH / NCRR. Jurkat клетки, набор 20 ВИЧ-1 Nef пептидов, а также кроличьих анти-ВИЧ-1 Nef антисыворотки были получены из NIH исследований СПИДа и программы ссылочные реагенты, (Rockville, MD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
Referências
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen?. Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef’s interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
