Biyobozunur Plastik Malç Filmler Aşağı Breaking potansiyeli ile Yerli Toprak Mikroorganizmaların izolasyonu Tarımda Kullanılan
Summary
Etiketli plastik film "biyolojik" malç olarak tarımsal kullanım için ticari olarak kullanılabilir. Toprak çekici bir bertaraf yöntemi temsil eder, ama saha şartlarında bozulma kötü anlaşılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, alanında mezar sonra plastik malç filmleri kolonize yerli toprak mantar ve bakterileri izole etmek için yöntemler geliştirmektir.
Abstract
Piyasada bulunan biyolojik malç (BDM) filmler kolonize tarım topraklara yerli mantar izole ve plastik aşağılamak için potansiyel için değerlendirildi. Tipik olarak, plastikten formülasyonlar bilinen ve ham madde kaynağı mevcuttur zaman, toz haline getirilmiş plastik temizleme bölgeleri görselleştirilmesi ile belirlenir ağar bazlı ortam ve bozulma içinde süspanse edilebilir. Ancak, bu yaklaşım kötü BDMs yerinde bozulması taklit eder. İlk olarak, BDMs toprak matrisi boyunca küçük parçacıklar halinde dağılmış değildir. İkinci olarak, BDMs saf polimerler olarak ticari olarak satılan değil, mikrobiyal büyümeyi etkileyebilir katkılar (örneğin dolgu maddeleri, yumuşatıcılar ve boyalar) içeren filmler gibi değildir. Burada tarif edilen prosedürler toprak gömülü malç filmleri elde izolatları için kullanılmıştır. Kazı BDMs elde mantar izole bir karbon kaynağı E içeren tanımlanan orta üstünde belirtilen yeni, disinfested BDMs parçaları üzerinde büyüme için ayrı ayrı test edildiagar xcept. BDMs büyüdü izolatlar daha BDMs tek karbon kaynağı ilave edildi sıvı ortam içinde test edildi. Yaklaşık on hafta sonra, mantar kolonizasyon ve BDM bozulması taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirildi. İzole edilen RNA gen dizilerinin analizi ile tespit edilmiştir. Bu rapor, mantar izolasyonu için yöntemleri açıklar fakat bakteriler de ikame ortam bakteriler için uygun olan bu metodlar kullanılarak izole edilmiştir. Bizim metodoloji plastik hammadde kullanılabilir ya bilinmeyen ya da hangi için sağlam plastik filmler ya da ürünlerin arıza araştıran çalışmalar için yararlı ispatlamak zorundadır. Ancak bizim yaklaşım BDM yıkımı oranları karşılaştırmak için kantitatif bir yöntem sağlamaz.
Introduction
Arıza ürün ömrü ve dayanıklılığı kısaltır çünkü bozulması tarihsel, plastik polimer istenmeyen bir özellik olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, doğal ortamda 1,2,3 plastik atık tarafından sunulan çevre sorunlarının bilincini biyolojik olarak parçalanabilen plastik geleneksel plastik malzeme için cazip bir alternatif haline getirmiştir. Bozulması (yapısal değişiklikler, parçalanma ve molekül ağırlığı azalma, bütünlüğü ve gücü 4,5 olarak tanımlanan) hem abiyotik süreçler (termal stres, fotoğraf-oksidasyon, hidroliz, erozyon ve mekanik stres) dahil olmak üzere bir dizi etkinlik,, ile gerçekleşir ve biyolojik bozulma 6. Abiyotik işlemleri parçası boyutu ve plastiklerin özelliklerini değiştirmek mümkün olmakla birlikte, mikroorganizmaların su ve karbon dioksit (aerobik şartlar altında) ve / veya metan (anaerobik koşullar altında) için nihai mineralizasyonu için gereklidir.
Için önemli bir nişplastik malç toprak nemi korumak için ve toprak sıcaklıkları 7,8 artırmak için, yabancı ot gelişimini engellemek için kullanıldığı yerlerde biyolojik olarak parçalanabilen plastik, tarım var. Sadece ABD'de dönüm yüz binlerce biyolojik olarak parçalanabilen plastik oluşan malç dahil plastik malç 9, kaplıdır. Bir ürün büyüme mevsimi ardından, biyolojik malç (BDMs) imha için seçenekleri bir depolama bertaraf, enerji geri kazanımı 10 yakma, kompost ile bozulmalarını veya toprak işleme 11 sonra toprakta bozulması içerir. Bunlardan, en az emek yoğun kaderi toprağa BDMs çiftçilik, ama olmayan kırpma ay (genellikle kışın) sırasında etkin bozulması ve mineralizasyon olmadan, plastik parçaları kalır ve tarım ekipmanları ile müdahale ilkbahar toprak işleme ve ekim sırasında, ve olabilir önemli ölçüde yaban hayatı, bitki, ve Mikrobiyota 1,2,3,10 etki ortamda devam etmektedir.
<p class = "jove_content"> tarım malç filmleri dahil olmak üzere birçok plastik ürünler, uygulamada, etiket "biyolojik" veya "gübrelenebilir" ayı olsa da, bozulma ve mineralizasyon in-toprak ayrışma için çok verimsiz ve / veya çok eksik olabilir bir olmak Bu ürünlerin bertarafı için alternatif. Örneğin, biyo-bozunur polietilen kompost sıcaklığı 25 ° C 12 yaşındayken ° C kompost ve mineralizasyon yarısından az miktarda meydana gelen 58 hava bir yıl ve takip eden üç ay sonra sadece% 12.4 mineralizasyonu elde etti. Kışın, çok noktada toprak sıcaklığı muhtemelen daha düşük mikrobiyal aktivite ve sonuç olarak, daha az mineralizasyon ile sonuçlanan, bu sıcaklıklarda ya da daha düşük olacaktır. Degradasyon oranı yavaş ilave olarak, terim "biyolojik olarak parçalanabilir" kötüye tarım sektöründe olanlar dahil olmak üzere tüketicilere 13,14 ile, bu ürünlerin güvensizlik yol açmıştır. Biyolojik dönüşümKarbon dioksit (ve / veya metan) ve mikroorganizmalar 4 doğal olarak meydana gelen suyun 14 için, polimerler. Bu nedenle, biyolojik kimyasal olarak ölçülmesi gereken, bir alt-tabaka ile mikroorganizmaların fiziksel ilişki, o malzemenin mikrobiyal bozulma anlamına gelmez.Tarımda BDMs sürdürülebilir kullanımı incelemek için bir çabanın bir parçası olarak, bu çalışmada kolonize ve piyasada bulunan BDMs aşağılamak tarım topraklara yerli mikroorganizmalar keşfetmek odaklanmıştır. Standart test yöntemleri kimyasal abiyotik ve biyolojik yollarla 15,16,17 ile biyolojik olarak parçalanabilen plastik dağılımı ölçmek için yayınlanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek tek mikrop türleri ile plastik bozulması adres, ya da izolasyonu için yöntem sağlamaz. Metodoloji Burada daha yakından mantar sporları ile numuneler aşılama sonrası mikrobik arıza direnci için plastik değerlendirmek için standart yöntemler benzer18,19.
Plastik formülasyonlar bilinen ve ham madde kaynağı mevcuttur zaman, toz haline getirilmiş plastik temizleme bölgeleri 13 görselleştirilmesi ile belirlenir ağar bazlı ortam ve bozulma içinde süspanse edilebilir. Bu yöntem, bu gibi poliüretan 20 gibi polimer düşürebilir mikroorganizmalar, poli-(bütilen süksinat-ko-adipat) 21, ve poli (laktik asit), 22 tanımlamak için önceden kullanılmıştır. Benzer bir yöntem, plastik tek karbon kaynağı 20,23 olduğu sıvı bir ortam içinde süspansiyon haline saf toz haline getirilmiş plastik içerir. Bu yöntemler tanımlanmış bir sistemin avantajı var, onlar kötü BDMs yerinde bozulması taklit. BDMs toprak matrisi boyunca küçük parçacıkların içerisinde dağılmış, daha ziyade, satılan ve filmler olarak kullanılmaz, çünkü İlk olarak, yüzey alanı farklı şekilde dağıtılır. İkinci olarak, BDMs kimyasal yapısına saf polimer farklıdır. BDMs genellikle gibi katkı maddeleri içerirdolgu maddeleri, yumuşatıcılar ve renklendiriciler, ve bu katkı maddeleri böylece mikrobiyal büyüme ve mineralizasyon oranını etkileyebilir. Bu çalışmada, ticari amaçlı film, bileşimin kendi alanında kullanıma hazır bir şekilde özel bir plastik film olduğu için, bu nedenle, ve mantar ve bakterilerin izole edilmesi için kullanılmıştır. Nerede bakteri izolasyonları için uygun değişiklikler dikkat ile basitlik için, aşağıdaki yöntemleri, mantarlar için sadece açıklanmıştır.
Toprakta bir kış için yeni bir çalışmada 24, üç piyasada bulunan BDMs ve bir deneysel film bir büyüme mevsimi için ABD'nin üç farklı bölgelerinde tarım bölgelerinde kullanılan ve daha sonra örgü (250 mikron) torbalara yerleştirilir ve gömülü Aynı sitelerde. 250 mikron elek boşluğu kök ve en toprak fauna hariç ve toprak tecavüz 25,26 en aza indirirken, mantar hif nüfuz sağlar. Naylon malzeme toprakta çanta bozulmasını önlemek. Ardından kazı, fungal izole DGM adet geri kazanılmış ve agar haricinde bir karbon kaynağı ve bir 5 cm'lik önceden disinfested olduğu yeni, kullanılmamış DGM filmin x 5 cm yüzey disinfested kare olmadan minimal ortam üzerinde büyüme için değerlendirildi. Film olarak kullanılan çoğu plastik bütünlüğü kaybı olmadan Otoklava, böylece UV ışığı plastik üzerinde bulunan herhangi bir mikrobiyal hücreleri öldürmek için kullanıldı. ISO 846 19% 70 etanol ve sonraki kurutma yüzey-disinfesting önerir, ancak bu yöntem kullanıyorsanız, bir filmin herhangi bir bileşen veya katkı maddesi olumsuz etanol etkilenir sağlamalıdır. BDMs muhtemelen güneş ışığına dayanacak şekilde imal olduğundan, UV bir dekontaminasyon yöntemi olarak seçildi.
Tek başına minimum ortamda daha iyi BDM parçaları üzerinde büyüdü izolatları daha fazla çalışma için seçilmiştir. Genellikle tarım ve tıbbi değil tarafından metabolik olarak kullanılmaz, çünkü Agar, deniz yosunları tarafından üretilen bir polisakkarit, mikrobiyal medya kuvvetlendirmek için kullanılırMikroorganizmaların mümkün olmakla birlikte, agar-hidrolize edici enzimler, aynı zamanda toprağın 28 izole edilmiş bakteriler deniz 27 ve agar-hidrolize bakterilerden izole edilmiştir. BDM polimerler ve agar potansiyel besin kaynağı olarak bu polimerlerin içeren ortamlarda gelişmiş değil toprak mantar, salgıladığı enzimler için nadir yüzeyler olması bekleniyor, ancak her iki yüzeylerde (Adım 7) burada tarif edilen plaka biyo mevcut her iki. Bir karbon kaynağı olarak BDMs değil Agar kullanmak mantar BDM film (deneysel)) agar (negatif kontrol), ii dışında i) ilave karbon kaynağı içeren agar-katılaşmış ortamda büyüme karşılaştırarak, sadece agar kullanmak mantar ayırt edilebilir ve iii), glukoz (pozitif kontrol). Tüm izolatların Büyüme az orta artı glikoz üzerinde bekleniyor; mantar kaynaklanan değil glukoz içeren plakalar deneyde kullanılan özel minimal ortamda büyüme yeteneğine sahip olmayabilir. Potential BDM degraders agar-katılaşmış az orta + yalnız agar-katılaşmış minimal ortamda büyümeye daha iyi BDM film büyümek gerekir. Az orta plakaları üzerinde büyüyen mantar agar-degraders veya oligotrophs ve aynı zamanda bioassay plakalar BDM filmlerle ilgili agar üzerinde büyümesi bekleniyor, ancak filmler kendilerini (onlar tesadüfen da BDM polimerler aşağılamak sürece) üzerinde.
Agar kullanımı değil, BDMs bir nedeniyle mikrobiyal büyüme görme olasılığını ortadan kaldırmak için, tanımlanmış suyu orta (Adım 9) bir biyo ile agar plaklarına BDM kolonizasyon için ilk test izledi. DGM adet biyo-tüpler içinde bilinen tek karbon kaynağı temsil etmektedir.
Ön değerlendirme ve izolatların gliserol stokları yeniden canlandırmak üzerine, bazı bilinen bir karbon kaynağı içeren sıvı tanımlanan ortamda kıt ama görünür misel kurdu. Bu sonuçlar alınan izolatlar, bazı oligot olduğunu düşündürmektedirrophs – karbon, nitrojen, ve sulu bir ortam veya hava 29,30,31 içinde uçucu olarak mevcut ya çözünmüş diğer besin maddeleri çok küçük miktarlarda atma büyümesi organizmalar. 18S ribozomal DNA analizi ile tür tayini bu görüşü destekler gibi eşleşen izolatların birçok mantar cins önce Besin düzeyinin düşüklüğü 32 gösterdiği bildirilmiştir. Yaygın saprofit olarak Oligotrophs, ortamlarda 30, bir dizi madde kullanımının metabolik kapasitesi geniş bir yelpazede gerektirir. Bu nedenle, BDMs (muhtemelen sıradışı enzimatik yetenekleri gerektiren) dışında biz izole aynı mantar oligotrofik kapasiteleri gösterdi ve bu havada parmak izi, toz veya iz uçucu alınan deri yağları gibi iz kirleticiler büyümeye başardık şaşırtıcı değildir. Oligotrophs ve izolasyon nedeniyle, bir BDM yüzeye büyümenin tek başına BDM arıza anlaması için kullanılamadı sonucuna vardı. Yöntemleri burada sc için çabalarımızı yansıtan tarifiyi niyetli BDM arıza için tarımsal topraklardan reen yerli BDM sömürgecilerin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Işlem burada toprak potansiyeli DGM degraders izole etmek için bir birinci geçiş tekniği temsil açıklanan ve başarılı bir şekilde yedi ay boyunca toprağa gömülü BDMs mantarlar izole etmek için kullanılmıştır. Mantarlar filmler mantar büyüme önleyici değildi aynı türden taze DGM malzeme üzerine reinoculated zaman izole edilmiş mantar gerçekten koloniciler olduğunu gösteren, büyümüş ve. Plastik-bozucu mantar ve bakterilerin izolasyonu potansiyel plastik bozulmuş olması gerekir toprak v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Stephen Meclis Üyesi, Dr David Yaprak ve Erin Macri minnetle mikroskobu ile yardım için kabul edilmiştir. Bu araştırma NIFA Özel Bitkileri Araştırma Girişimi, ABD Tarım Bakanlığı scri-SREP Hibe Ödülü No 2.009-02.484 bir hibe ile finanse edildi. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry ve Nicole Sallee mükemmel teknik destek ve düşünceli tartışmaları sağladı.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Becton Dickinson | 8X05491 | |
| Agar | Fisher | BP 1423-2 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics | 200-287-4 | |
| Glutaraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16216-10 | Toxic |
| Molecular sieve | Fisher | M-8892 | |
| Ethanol | Pharmco-Aaper | E200 | |
| Contrex | Decon Labs, Inc. | 5204 | |
| Parafilm M | Pechiney Plastic Packaging | S37440 | |
| Mineral salts for buffers and media | Fisher | Various | Various vendors sell these reagents |
Referências
- Gregory, M. R. Environmental implications of plastic debris in marine settings – entanglement, ingestion, smothering, hangers-on, hitch-hiking and alien invasions. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2013-2025 (2009).
- Teuten, E. L., Saquing, J. M., et al. Transport and release of chemicals from plastics to the environment and to wildlife. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2027-2045 (2009).
- Thompson, R. C., Moore, C. J., vom Saal, F. S., Swan, S. H. Plastics the environment and human health: current consensus and future trends. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2153-2166 (2009).
- ASTM D 883. . Standard terminology relating to plastics. , (1991).
- SO 472. . Plastics – vocabulary, amendment 3. General terms and terms relating to degradable plastics. , (1993).
- Krzan, A., Hemjinda, S., Miertus, S., Corti, A., Chiellini, E. Standardization and certification in the area of environmentally degradable plastics. Polymer Degradation and Stability. 91, 2819-2833 (2006).
- Shogren, R. L. Biodegradable mulches from renewable resources. Journal of Sustainable Agriculture. 16, 33-47 (2000).
- Takakura, T., Fang, W. . Climate under cover. , 1-10 (2001).
- Miles, C., Hayes, D., Brodhagen, M., Lee, J., Wszelaki, A., Moore-Kucera, J., Wallace, R., Marsh, T., Inglis, D., van Steenbergen, F., Tuinhof, A., Knoop, L. Plastic mulches, biodegradable alternatives, China and US. Transforming Landscapes, Transforming Lives: The Business of Sustainable Water Buffer Management. , (2011).
- Song, J. H., Murphy, R. J., Narayan, R., Davies, G. B. H. Biodegradable and compostable alternatives to conventional plastics. Transactions of the Royal Society B. 364, 2127-2139 (2009).
- Hayes, D. G., Dharmalingam, S., Wadsworth, L. C., Leonas, K. K., Miles, C., Inglis, D. A., Khemani, K. C., Scholz, C. Biodegradable agricultural mulches derived from biopolymers. Degradable polymers and materials, principles and practice. ACS Symposium Series. 1114, 201-223 (2012).
- Ojeda, T. F. M., Dalmolin, E., Forte, M. M. C., Jacques, R. J. S., Bento, F. M., Camargo, F. A. O. Abiotic and biotic degradation of oxo-biodegradable polyethylenes. Polymer Degradation and Stability 94. , 965-970 (2009).
- van der Zee, M., Lendlein, A., Sisson, A. Analytical methods for monitoring biodegradation processes of environmentally degradable polymers. Handbook of Biodegradable Polymers. , 263-281 (2011).
- Narayan, R. Misleading claims and misuse of standards continues to proliferate in the nascent bioplastics industry space. BioPlastics. 01/10, (2010).
- ASTM D 5338-98. Standard test method for determining aerobic biodegradation of plastic materials under controlled composting conditions. Annual Book of ASTM Standards. , 504-509 (1998).
- ASTM D 5988-03. Standard test method for determining aerobic biodegradation in soil of plastic materials or residual plastic materials after composting. Annual Book of ASTM Standards. , 354-358 (2003).
- ASTM D 6954-04. Standard guide for exposing and testing plastics that degrade in the environment by a combination of oxidation and biodegradation. Annual Book of ASTM Standards. , 748-753 (2004).
- ASTM G21-96. Standard practice for determining resistance of synthetic polymeric materials to fungi. Annual Book of ASTM Standards. , 433-437 (2002).
- ISO 846. . Plastics – evaluation of the action of microorganisms. , 1-22 (1997).
- Russell, J. R., Huang, J., et al. Biodegradation of polyester polyurethane by endophytic fungi. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6076-6084 (2011).
- Maeda, H., Yamagata, Y., Abe, K., Hasegawa, F., Machida, M., Ishioka, R., Gomi, K., Nakajima, T. Purification and characterization of a biodegradable plastic-degrading enzyme from Aspergillus oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 67, 778-788 (2005).
- Tokiwa, Y., Calabia, B. P. Biodegradability and biodegradation of poly(lactide. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 244-251 (2006).
- Karjomaa, S., Suortti, T., Lempiäinen, R., Selin, J. -. F., Itävaara, M. Microbial degradation of poly-(L-lactic acid) oligomers. Polymer Degradation and Stability. 59, 333-336 (1998).
- Miles, C., Wallace, R., et al. Deterioration of potentially biodegradable alternatives to black plastic mulch in three tomato production regions. HortScience. 47 (9), 1270-1277 (2012).
- Hedh, J., Wallander, H., Erland, S. Ectomycorrhizal mycelial species composition in apatite amended and non-amended mesh bags buried in a phosphorus-poor spruce forest. Mycological Research. 112, 681-688 (2008).
- Wallander, H., Hagerberg, D. Do ectomycorrhizal fungi have a significant role inweathering of minerals in forest soil?. , (2003).
- Hehemann, J. -. H., Correc, G., et al. Biochemical and structural characterization of the complex agarolytic enzyme system from the marine bacterium Zobellia galactanivorans. Journal of Biological Chemistry. 287, 30571-30584 (2012).
- Stanier, R. Y. Studies on marine agar-digesting bacteria. Journal of Bacteriology. 42 (4), 527-559 (1941).
- Hirsch, P. Microbial life at extremely low nutrient levels. Advances in Space Research. 6, 287-298 (1986).
- Wainwright, M., Adam, T., Barakah, F. A review of the role of oligotrophic micro-organisms in biodeterioration. International Biodeterioration and Biodegradation. 31, 1-13 (1993).
- Wainwright, M., Barakah, R., Al-Turk, I., Ali, T. A. Oligotrophic micro-organisms in industry, medicine, and the environment. Science Progress. 75, 313-322 (1991).
- Parkinson, S. M., Wainwright, M., Killham, K. Observations on oligotrophic growth of fungi on silica gel. Mycological Research. 93 (4), 529-534 (1989).
- Hill, T., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Newsletter. 48, 20-21 (2001).
- Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some approaches to the study of the role of metals in the metabolism of microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94, 152-170 (1950).
- Affeldt, K. J., Brodhagen, M., Keller, N. P. Aspergillus oxylipin signaling and quorum sensing pathways depend on G protein-coupled receptors. Toxins. 4, 695-6171 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
- Marzluf, G. A., Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. Physiology, metabolism, and molecular aspects of filamentous fungi. Methods for General and Molecular Microbiology. , 952-964 (2007).
- Peters, J. E., Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. Gene transfer in Gram-negative bacteria. Methods for General and Molecular Microbiology. , 735-755 (2007).
- Yabannavar, A. V., Bartha, R. Methods for assessment of biodegradability of plastic films in soil. Applied and Environmental Microbiology. 60 (10), 3608-3614 (1994).
