Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem
Summary
Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.
Abstract
Kontrolsüz glisemi diabetes mellitus bir özelliğidir ve nöropati, nefropati ve retinopati gibi hastalıklarının teşvik etmektedir. Diyabet, immün-aracılı tip 1 ve obezite bağlantılı tip 2 hem de diyabet patofizyolojisi ve tedavi mekanizmalarını ortaya koymaya yönelik çalışmaların artan yaygınlığı ile kritik bir önem taşımaktadır. Langerhans pankreatik adacıkların β-hücrelerinin uygun bir şekilde, yüksek kan şekeri konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgılayan sorumludur. Glikoz ve diğer besinler, β-hücrelerinin aynı zamanda belirli hormonlar tarafından uyarılır Buna ek olarak, hücre içi siklik adenozin monofosfat üretimini artırmak β-hücresi reseptörleri üzerinde bir yemek ve hareket yanıt olarak bağırsak salgılanan inkretinler, (adlandırılır cAMP). Azalmış β-hücre fonksiyonu, kütle ve iç salgı bezi yanıt tip 2 diyabet patofizyolojisi katkıda iyi anlaşılmış olup, aynı zamanda giderek wi bağlantılı ediliyorinci tip 1 diyabet. Mevcut fare adacık izolasyon ve cAMP tespit protokolü hastalığın ilerlemesini ve terapötik müdahaleler, hücre içi cAMP üretiminin modülasyonu yoluyla hareket reseptörlerini inkretindir reseptörlerinin aracılık ettiği veya ilgili olduğu özellikle teşvik mekanizmaları tanımlamak yardımcı bir araç olabilir. Sadece cAMP ölçümleri tarif edilecek olmasına rağmen, tarif edilen doku adacığı izolasyonu protokolü de glikoz insülin salgılanmasını, [3H]-timidin katılması, protein bolluğu ve mRNA ifadesi uyarılmış de dahil olmak üzere diğer pek çok alt uygulamalar için izin temiz bir hazırlık oluşturur.
Introduction
Öglisemi sıkı bakım kontrolsüz tip 1 ve 2 diyabet 1 patoloji tüm özellikleridir nöropati, nefropati ve retinopati, hastalıklarının önlenmesi için zorunludur. Tip 1 ve tip 2 diyabetli hem de azaltılmış β-hücre fonksiyonu ve kütle kan glikozu konsantrasyonlarını 2 de karıştırabilir. Insülin üreten β-hücrelerinin, bozulmuş β-hücresi insülin salgılama ve çevresel insülin türü sinyal 2 diyabet yıkıcı kaybı immün aracılı tip 1 diyabet, birlikte hiperglisemi, dislipidemi ve sonunda ile sonuçlanan, artan hepatik glikoz üretimini teşvik Oysa β-hücrelerinin ayrı ayrı 3 β-hücre kütlesi ve insülin salgılama kapasitesinin kaybı. iki Tip 1 ve tip 2 diyabet ilerlemesinde temel β-hücresi mekanizmaların anlaşılması, bu hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için yeni tedavilere yol açacaktır.
Vitro ti içindeBöyle INS-1 ve MIN6 gibi ssue kültür modelleri, β-hücre hatları ölümsüzleştirdi spesifik β-hücre fonksiyonlarını anlamak için yararlı bir araç olabilir. Bununla birlikte, adacık içinde farklı hücre tipleri arasında etkileşim kendileri β-hücresi fonksiyonunu regüle olabilir. Örneğin, glukagon parakrin etkisi (α-hücrelerinden salınan) ve insülin salgılanmasını artan ve azalan somatostatin (δ-hücrelerinden salınan), sırasıyla, endokrin tepkisinin 4 hücre, hücre yakınlık önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca, β-hücreleri arasındaki ara bağlantılar insülin 5 salınımını mümkün kılmaktadır. Adımlar daha glikoz için izole edilmiş adacık fizyolojik yanıtı çoğaltılmış insülinom çizgileri üreten yapılmıştır, ancak ayrıca, (örneğin, INS-1-türevi 832/13 ve 832/3 hücre çizgileri), glikoz yanıt yine de, normal fare farklıdır 6,7 adacıklarının. Ayrıca, bu klonal insülinoma hücre çizgilerinin tepkiglukagon benzeri peptid-1 (GLP-1), bunların agonistlere karşı birbirinden önemli ölçüde farklı, hem de normal adacık 6 olabilir. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi hücre hatları Maddeleri cAMP üretimi üzerinde etkisi olduğu tahlil için en iyi modeli temsil olmayabilir.
Insülinom-türevi hücre hatlarının tersine, bütün hayvan modellerinde, sadece β-hücresi fonksiyonu çalışmalarında komplikasyonların kendi kümesi sunar. Endokrin dokusu ile çalışan en büyük zorluklardan biri serbest hormon kesin konsantrasyonu ölçülmesidir. Özel olarak, karaciğer insülin metabolize önemli bir rol oynar ve kan akışı pankreas, karaciğer doğrudan gider. Böylece, plazma insülin ölçümü doğru pankreas kendisi veya insülin salgılanmasının 8'in oranı farklı tedavilerin etkisinden salgılanan insülinin miktarda tasvir olmayabilir. Ayrıca, glukagon renal metabolizması α-adacık hücreleri 9 glukagon çıkış güvenilirliğini sınırlayabilir. Bu nedenle, in vitro deney için primer fare adacıkları izole adacık in vivo koşullarında yapılan ölçümler güzelleştirmek için belli bir uyarana yanıt nasıl daha kesin bir anlaşılmasını sağlar.
Fare adacıklar izolasyonu için mevcut protokol (başarısını artırmak için yardımcı olabilir hafif değişiklikler) gruplarının bir dizi 10,11 tarafından kullanılan köklü bir protokoldür. Buna ek olarak, cAMP üretiminin belirlenmesi β-hücrelerinin iç salgı bezi yanıt doğrudan bir-okuma sağlar. CAMP ölçümü, protein içeriği ve insülin salgılanması ile bağlantılı olarak da β-hücre fonksiyonu bir kusur cAMP 10 proksimal veya distal yatıyor belirlemek için yardım, aynı cAMP numune hazırlık dan ölçülebilir. Bu protokol son cAMP içeriği ve insülin salgılanması uygulama aralarında, ilaç ve diyet bileşenlerinin etkisini anlamak için çok güçlü bir araç olabilirs, cAMP ve insülin salgılanması üzerinde. Tek başına glikozdan uyarılmaya ek olarak, diğer bileşikler, cAMP ve insülin salgılanması 10,11 değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.
İzole adacık insülin, glukagon ve bu tür somatostatin gibi diğer hormonlar,, hem de sitokinler, eikosanoidler ve siklik adenozin monofosfat ikinci tahlil birincil hormon olmasına rağmen, son olarak, aynı zamanda geçici bir uyarma deneyi ile ya da miktarının ölçülmesi ile, ya ölçülebilir kültür ortamında 12 kendi seviyeleri. Son olarak, diğer birçok uygulamalar, alt doku adacığı transplantasyonu, PCR ya da mikro-dizi analizi, nicel gerçek zaman RNA izolasyonu, bir protein olarak, takip edilebilir, böylece dış Bu yazının kapsamı, tarif edilen kolajenaz izolasyon yöntemi ile doku adacığı izolasyonu adacık koruma sağlar, ancak Western lekeleme, adacık yerleştirmesi ve immünofloresan görüntüleme ve adacık hücresi Repli bir ölçüsü olarak, [3H]-timidin dahil edilmesi için izolasyonÖnceki JoVE makalelerinde 13-16 'de tarif edilmiştir bazıları katyondur. Genel olarak, protokolde tarif adacık izolasyon prosedürü takip tedavilerin geliştirilmesi ve β-hücre fonksiyonu artırmaya yönelik ilaç keşfi teşvik için önemli ve yararlı bilgiler içeren bir araştırmacı sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dünya nüfusunun% 7.7 etkileyebilecek tahmin diyabet yaygınlığı ile, yeni araştırma tekniklerinin gereksinimi hem anlamak ve diyabet 18 tedavisi zorunludur. Mevcut adacık izolasyon in vitro deney için kullanılan bir iyi kurulmuş bir protokoldür ve hafif değişiklikler 11,14,16 ile daha önce sunulmuştur. Insülin salgılanması gibi, cAMP gibi yukarı bileşenleri üzerinde odaklanarak, izole adacık için ortak bir alt bir uygulama olmakla birlikte, insülin üretimini ve sa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu çalışmada açıklanan protokollere uzman teknik yardım için Renee L. Pasker ve Harpreet K. Brar teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bize zaman izin laboratuvar üyelerinin desteği ile birlikte, Wisconsin-Madison Üniversitesi Duke Üniversitesi ve Alan D. Attie, Christopher B. Newgard ve danışmanlık kabul ve optimize etmek için gerekli destek istiyoruz açıklanan protokolleri. Özellikle, verimli tartışmalar ve tavsiye için Attie Laboratuarında Hans HOHMEIER, Danhong Lu, ve Helena Winfield Newgard Laboratuvarı ve Mary Rabaglia teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DK080845 ve Çocuk Diyabet 594 tarafından desteklenen
(MEK) Araştırma Vakfı hibe 17-2011-608
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Referências
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
