Metode til mus pancreasø Isolation og intracellulære cAMP Bestemmelse
Summary
Analysering in vitro β-celle funktion ved hjælp af isolerede mus Langerhanske øer er en vigtig komponent i studiet af diabetes patofysiologi og sygdomsbehandling. Mens mange downstream applikationer er tilgængelige, protokollen specifikt beskriver måling af intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) som en væsentlig parameter, β-celle funktion.
Abstract
Ukontrolleret glykæmi er kendetegnende for diabetes mellitus og fremmer følgesygdomme såsom neuropati, nefropati og retinopati. Med den stigende forekomst af diabetes, både immun-medieret type 1 og fedme-linked type 2, undersøgelser med henblik på at afgrænse diabetes patofysiologi og terapeutiske mekanismer er af afgørende betydning. De β-cellerne i de Langerhanske øer af Langerhans er ansvarlige for passende udskillende insulin som respons på forhøjede glucosekoncentrationer. Betegnes Inkretinerne, som udskilles fra tarmen som reaktion på et måltid og handle på β-celle-receptorer, der øger produktionen af intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (i tillæg til glucose og andre næringsstoffer, er β-celler stimuleret af specifikke hormoner, cAMP). Nedsat β-celle funktion, masse og inkretin reaktionsevne er godt forstået at bidrage til patofysiologien af type 2-diabetes, og er også i stigende grad forbundet with type 1-diabetes. Den nuværende mus islet isolation og protokol cAMP beslutsomhed kan være et redskab til at hjælpe afgrænse mekanismer, der fremmer sygdomsprogression og terapeutiske indgreb, især dem, der er medieret af inkretinniveauer receptorer eller beslægtede receptorer, der virker gennem modulering af intracellulær cAMP produktion. Mens kun cAMP målinger vil blive beskrevet, og den beskrevne islet isolation protokol skaber en ren præparat, der også giver mulighed for mange andre downstream applikationer, herunder glucose insulinsekretion, [3H]-thymidin, protein overflod, og mRNA-ekspression.
Introduction
Den strenge vedligeholdelse af euglykæmi er bydende nødvendigt at forhindre følgesygdomme såsom neuropati, nefropati og retinopati, som alle er kendetegnende for patologien af ukontrolleret type 1 og 2 diabetes 1. Reduceret β-celle funktion og masse i både type 1 og 2 diabetes forstyrrer blodsukkerkoncentrationen 2. Betragtninger immun-medieret type 1-diabetes resultater fra en ødelæggende tab af insulin-producerende β-celler, nedsat β-celle insulinsekretion og perifer insulin signalering i type 2-diabetes sammen fremme hyperglykæmi, dyslipidæmi og øget hepatisk glukose produktion, hvilket i sidste ende resulterer i både tab af β-cellemasse og insulin sekretorisk kapacitet fra de enkelte β-celler 3. Forståelse af de underliggende β-celle-mekanismer i udviklingen af type 1 og 2 diabetes vil forhåbentlig give anledning til hidtil ukendte terapier til forebyggelse og behandling af disse sygdomme.
In vitro tissue kultur modeller, såsom INS-1 og MIN6 udødeliggjort β-cellelinjer kan være nyttige redskaber til at forstå bestemte β-celle funktioner. Imidlertid kan vekselvirkninger mellem forskellige celletyper i ø selv regulerer β-celle funktion. For eksempel parakrin indflydelse glucagon (frigivet fra α-celler) og somatostatin (frigivet fra δ-celler) i stigende og faldende insulinsekretion henholdsvis viser betydningen af cell nærhed i det endokrine respons 4. Desuden gap junctions mellem β-celler potenserer frigivelsen af insulin 5.. Selv om fremskridt er gjort i at generere insulinom linjer, der bedre kopierede den fysiologiske reaktion af isolerede øer til glukose (f.eks INS-1-afledt 832/13 og 832/3 cellelinjer), deres glukose lydhørhed stadig adskiller sig fra normal rotte holme 6,7. Desuden reaktion af disse klonale insulinom cellelinjerat glucagon-lignende peptid-1 (GLP-1)-agonister kan variere drastisk fra hinanden samt fra normale øer 6. Derfor kan udødeliggjort cellelinjer repræsenterer ikke den bedste model for analyse agenter, der har indflydelse på cAMP produktion.
I modsætning til de insulinom-cellelinjer, studerer β-celle funktion udelukkende hele dyremodeller har sit eget sæt af komplikationer. En af de største udfordringer i arbejdet med endokrine væv måler den præcise koncentration af hormon frigivet. Specifikt spiller leveren en vigtig rolle metaboliserende insulin og bugspytkirtlen blodgennemstrømning går direkte til leveren. Således kan en plasma insulin måling ikke præcist skildre mængder insulin bliver udskilt fra bugspytkirtlen selv eller virkningen af forskellige behandlinger på hastigheden af insulinsekretion 8. Endvidere kan renale metabolisme af glukagon begrænser pålideligheden af glukagon output fra ø-α-celler 9. Derfor isolere primære mus holme til in vitro eksperimenter giver en mere præcis forståelse af, hvordan holmen reagerer på bestemte stimuli til at supplere målinger foretaget in vivo.
Den nuværende protokol til isolering af mus holme er en veletableret protokol, der bruges af en række grupper (med mindre ændringer, der kan bidrage til at øge succes) 10,11. Desuden bestemmelse af cAMP-produktion giver mulighed for en direkte udlæsning af inkretin reaktionsevne af β-celler. I forbindelse med cAMP-måling, proteinindhold og insulinsekretion kan også kvantificeres fra samme lejr prøve prep, hjælpe med at afgøre, om en defekt i β-celle funktion ligger proksimalt eller distalt til Camp 10. Det endelige cAMP indhold og insulinsekretion ansøgning i denne protokol kan være et meget stærkt værktøj til at forstå indflydelsen af farmaceutiske og kosten bestanddele, blandt andets, om cAMP og insulinsekretion. Ud over stimulation fra glucose alene, kan andre forbindelser anvendes til at måle ændringer i cAMP og insulinsekretion 10,11.
Endelig, selv om insulin er den primære hormon vi analysere fra isolerede øer, andre hormoner, såsom glucagon og somatostatin, såvel som cytokiner, eicosanoider og cyklisk adenosinmonophosphat, kan også måles enten ved en forbigående stimulation assay eller ved kvantificering af niveauet i dyrkningsmedium 12. Endelig, selv uden for rammerne af dette manuskript, ø isolation med den beskrevne collagenase isolation metode giver mulighed for islet konservering så mange andre downstream-applikationer kan forfølges, såsom holmen transplantation, RNA isolation til kvantitativ real time PCR eller microarray analyser, protein isolation for Western blotting, islet indlejring og immunofluorescent billedbehandling og [3H]-thymidin som et mål for øcelle opformeringenkation, hvoraf nogle er blevet beskrevet i tidligere JOVÉ artikler 13-16. Samlet set kan efter holmen isolation, der er beskrevet i protokollen giver en forsker med vigtige og nyttige informationer for at udvikle behandlingsformer og fremme lægemiddelforskning til formål at forbedre β-celle funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med udbredelsen af diabetes forventes at påvirke 7,7% af verdens befolkning, er kravet om nye forskning teknikker er afgørende for både at forstå og behandle diabetes 18.. Den nuværende holm isolation er en veletableret protokol, der bruges til in vitro-eksperimenter og er blevet præsenteret tidligere med små modifikationer 11,14,16. Selvom insulinsekretion er en fælles nedstrøms ansøgning om isolerede holme, med fokus på upstream bestanddele, såsom cAMP, kan hjælpe med at afg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Renee L. Pasker og Harpreet K. Brar for ekspert teknisk bistand på de protokoller, der er beskrevet i dette arbejde. Desuden vil vi gerne anerkende mentoring af Christopher B. Newgard ved Duke University og Alan D. Attie ved University of Wisconsin-Madison, sammen med støtte fra deres laboratorium medlemmer, som tilladt os tid og støtte nødvendigt at optimere beskrevne protokoller. I særdeleshed, vi takker Hans Hohmeier, Danhong Lu, og Helena Winfield i Newgard Laboratory og Mary Rabaglia i Attie laboratorium for produktive diskussioner og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud DK080845 og Juvenile Diabetes 594
Research Foundation tilskud 17-2011-608 (til MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Referências
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
