Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling
Summary
Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.
Abstract
Ongecontroleerde glycemie is een kenmerk van diabetes mellitus en bevordert morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie. Met de toenemende prevalentie van diabetes, zowel immuun-gemedieerde type 1 en obesitas verbonden type 2, studies gericht op het afbakenen van diabetes pathofysiologie en therapeutische mechanismen van essentieel belang zijn. De β-cellen van de pancreatische eilandjes van Langerhans zijn verantwoordelijk voor passende afscheiden insuline in reactie op verhoogde bloedglucoseconcentraties. Naast glucose en andere voedingsstoffen, worden de β-cellen gestimuleerd door specifieke hormonen, genaamd incretines, die worden uitgescheiden uit de darm in reactie op een maaltijd en werken op β-cel receptoren die de productie van intracellulair cyclisch adenosine monofosfaat verhogen ( cAMP). Verminderde β-celfunctie, massa en incretine responsiviteit zijn goed zou bijdragen aan de pathofysiologie van type 2 diabetes, en worden ook steeds gekoppeld with type 1 diabetes. De huidige muis eilandje isolatie en cAMP vastberadenheid protocol kan een hulpmiddel om af te bakenen mechanismen ter bevordering van progressie van de ziekte en therapeutische interventies, met name degenen die worden gemedieerd door de incretin receptoren of verwante receptoren die werken door middel van modulatie van intracellulaire cAMP productie. Terwijl slechts cAMP metingen worden beschreven, beschreven eilandje isolatieprotocol creëert een schone preparaat die ook zorgt voor veel andere stroomafwaartse toepassingen, waaronder glucose gestimuleerde insuline secretie, [3H]-thymidine, eiwitgehalte en mRNA expressie.
Introduction
De strikte handhaving van euglycemia is noodzakelijk om morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie, die alle kenmerken van de pathologie van ongecontroleerde type 1 en 2 diabetes 1 worden voorkomen. Verminderde β-celfunctie en massa zowel type 1 en 2 diabetes verstoren bloedglucoseconcentraties 2. Dat immuun-gemedieerde type 1 diabetes resultaten van een verwoestende verlies van insulineproducerende β-cellen, verminderde β-cel insulinesecretie en perifere insuline signalering van Type 2 diabetes samen bevorderen hyperglycemie, dyslipidemie en verhoogde hepatische glucoseproductie, wat uiteindelijk resulteert in zowel verlies van β-celmassa en insuline secretoire capaciteit van individuele β-cellen 3. Inzicht in de onderliggende β-cel mechanismen in de progressie van type 1 en 2 diabetes hopelijk leiden tot nieuwe therapieën ter voorkoming en behandeling van deze ziekten.
In vitro tissue cultuur modellen, zoals de INS-1 en MIN6 β-geïmmortaliseerde cellijnen, kunnen nuttige hulpmiddelen voor het begrijpen van specifieke β-celfuncties. De wisselwerking tussen de verschillende celtypes in de eilandjes kunnen zelf regelen β-celfunctie. Bijvoorbeeld, de paracriene invloed van glucagon (vrijgemaakt uit α-cellen) en somatostatine (vrijgemaakt uit δ-cellen) in stijgende en dalende insuline secretie, respectievelijk, toont het belang van cel-cel in de nabijheid endocriene respons 4. Bovendien gap junctions tussen β-cellen versterken de afgifte van insuline 5. En hoewel vooruitgang geboekt bij het genereren insulinoma lijnen die beter gerepliceerd de fysiologische respons van geïsoleerde eilandjes tot glucose (bijvoorbeeld de INS-1-afgeleide 832/13 en 832/3 cellijnen), de glucose response verschilt nog van normale rat eilandjes 6,7. Bovendien is de respons van deze klonale cellijnen insulinomaglucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) agonisten drastisch verschillen van elkaar, en van normale eilandjes 6. Daarom kan geïmmortaliseerde cellijnen vertegenwoordigen de beste model voor het testen van middelen die invloed op cAMP-productie.
In tegenstelling tot de-insulinoom afgeleide cellijnen, het bestuderen van β-cel functie uitsluitend in gehele dierlijke modellen heeft zijn eigen set van complicaties. Een van de grootste uitdagingen bij het werken met endocriene weefsel meet de precieze concentratie hormoon vrijgegeven. Specifiek, de lever speelt een belangrijke rol metaboliseren insuline en de alvleesklier bloedstroom gaat rechtstreeks naar de lever. Zo kan een plasma insuline meting niet nauwkeurig beeld van de hoeveelheden insuline wordt uitgescheiden door de alvleesklier zelf of de impact van verschillende behandelingen op de snelheid van de insuline secretie 8. Bovendien kan niermetabolisme van glucagon de betrouwbaarheid van glucagon productie beperken van eilandje α-cellen 9. Daarom is het isoleren van primaire muis eilandjes voor in vitro experimenten geeft een duidelijker inzicht in hoe het eilandje reageert op specifieke stimuli om metingen in vivo te vullen.
Het huidige protocol voor de isolatie van de muis eilandjes is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt door een aantal groepen (met lichte wijzigingen die kunnen helpen om succes te vergroten) 10,11. Bovendien is de bepaling van cAMP-productie maakt een directe aflezing van de incretine responsiviteit van de β-cellen. Samen met cAMP meet, eiwitgehalte en insuline secretie kan worden gekwantificeerd uit hetzelfde cAMP monstervoorbereiding, om te bepalen of een defect in β-celfunctie ligt proximaal of distaal van cAMP 10. Het uiteindelijke cAMP gehalte en insuline secretie toepassing in dit protocol kan een zeer krachtig instrument voor het begrijpen van de invloed van de farmaceutische en voedingsbestanddelen, onder andere zijns op cAMP en insuline secretie. Naast het stimuleren van glucose alleen, kunnen andere verbindingen worden gebruikt om veranderingen in cAMP en insuline secretie 10,11 meten.
Tot slot, hoewel insuline is de primaire hormoon we assay van geïsoleerde eilandjes, andere hormonen, zoals glucagon en somatostatine, maar ook cytokinen, eicosanoïden, en cyclisch adenosine monofosfaat, kan ook worden gemeten, hetzij door een tijdelijke stimulatie test of kwantificatie van hun niveau in kweekmedium 12. Tot slot, hoewel buiten de reikwijdte van dit manuscript, eilandje isolatie met de beschreven collagenase isolatiemethode maakt eilandje conservering zodat vele verdere toepassingen kan worden uitgeoefend, zoals eilandjeoverplanting, RNA isolatie kwantitatieve real time PCR en microarray analyses, eiwit isolatie voor Western blotting, eilandje inbedding en immunofluorescentie imaging en [3H]-thymidine opname als een maat eilandje cellen replikation, waarvan sommige zijn beschreven in eerdere artikelen Jupiter 13-16. Over het algemeen, als gevolg van de in het protocol beschreven eilandje isolatie procedure kan een onderzoeker met belangrijke en nuttige informatie voor het ontwikkelen van therapieën en bevorderen van drug discovery gericht op verbetering van β-cel functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de prevalentie van diabetes naar verwachting invloed hebben op 7,7% van de wereldbevolking, de eis van nieuwe onderzoekstechnieken is het noodzakelijk om zowel te begrijpen en te behandelen diabetes 18. De huidige eilandje isolatie is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt voor in vitro experimenten en is al eerder gepresenteerd met lichte wijzigingen 11,14,16. Hoewel insuline secretie is een veel voorkomende downstream applicatie voor geïsoleerde eilandjes, met de nadruk op upstr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Renee L. Pasker en Harpreet K. Brar bedanken voor deskundige technische bijstand aan de in dit werk beschreven protocollen. Verder willen we de begeleiding van Christopher B. Newgard erkennen aan de Duke University en Alan D. Attie aan de Universiteit van Wisconsin-Madison, samen met de steun van hun laboratorium leden, wat ons toeliet de tijd en ondersteuning nodig om het optimaliseren van de beschreven protocollen. In het bijzonder danken wij Hans Hohmeier, Danhong Lu, en Helena Winfield in de Newgard Laboratorium en Mary Rabaglia in de Attie Laboratorium voor productieve discussies en advies. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie DK080845 en Juvenile Diabetes 594
Research Foundation subsidie 17-2011-608 (MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Referências
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
