Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination
Summary
Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire pt utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.
Abstract
Glycémie non contrôlée est une caractéristique du diabète sucré et favorise morbidités comme la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie. Avec la prévalence croissante du diabète, à la fois auto-immune de type 1 et lié à l'obésité de type 2, des études visant à délimiter le diabète physiopathologie et les mécanismes thérapeutiques sont d'une importance critique. Les β-cellules d'îlots pancréatiques de Langerhans sont responsables de la sécrétion de l'insuline de façon appropriée en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. En plus du glucose et d'autres nutriments, les cellules β sont également stimulés par des hormones spécifiques, appelées incrétines, qui sont sécrétées par l'intestin en réponse à un repas et d'agir sur les récepteurs β-cellulaires qui augmentent la production d'adénosine monophosphate cyclique intracellulaire ( cAMP). Diminution de la fonction β-cellulaire, la masse, et la réactivité de l'incrétine sont bien comprises de contribuer à la physiopathologie du diabète de type 2, et sont de plus en plus liés wile diabète de type 1 e. L'isolement actuel de l'îlot de la souris et de l'AMPc protocole de détermination peut être un outil pour aider à délimiter les mécanismes favorisant la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques, en particulier ceux qui sont médiés par les récepteurs de l'incrétine ou récepteurs qui agissent par modulation de la production d'AMPc intracellulaire liée. Bien que seules des mesures d'AMPc vont être décrits, le protocole d'isolement des îlots de Langerhans décrit crée une préparation propre, qui permet également de nombreuses autres applications en aval, y compris le glucose stimulé la sécrétion d'insuline, la [3 H]-thymidine, abondance des protéines, et l'expression de l'ARNm.
Introduction
Le maintien strict de euglycémie est impératif de prévenir les pathologies telles que la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie, qui sont toutes des caractéristiques de la pathologie de incontrôlée de type 1 et 2 de diabète 1. Fonction β-cellulaire réduite et la masse à la fois de type 1 et diabète de type 2 perturbent les concentrations de glucose dans le sang 2. Alors que le type auto-immune 1 diabète résulte d'une perte dévastatrice de cellules β productrices d'insuline, troubles de β-cellulaire sécrétion d'insuline et périphérique signalisation de l'insuline dans le diabète de type 2, ainsi que de promouvoir l'hyperglycémie, la dyslipidémie, et augmentation de la production hépatique de glucose, ce qui entraîne par la suite dans à la fois la perte de masse β-cellulaire et de l'insuline sécrétoire capacité de β-cellules individuelles 3. Comprendre les mécanismes sous-jacents β-cellules dans la progression de type 1 et diabète de type 2, nous l'espérons donner lieu à de nouvelles thérapies pour prévenir et traiter ces maladies.
Dans ti vitrodes modèles de culture uestion, tels que l'INS-1 et MIN6 immortalisés lignes β-cellulaires, peuvent être des outils utiles pour la compréhension des fonctions spécifiques β-cellules. Cependant, les interactions entre les différents types de cellules au sein de l'îlot peut se réguler la fonction β-cellulaire. Par exemple, l'influence paracrine de glucagon (libérée à partir de cellules-α) et la somatostatine (libéré à partir des cellules-δ) en augmentant et en diminuant la sécrétion d'insuline, respectivement, démontre l'importance de la proximité de la cellule de la cellule dans la réponse endocrinienne 4. En outre, les jonctions communicantes entre les cellules-β potentialisent la libération d'insuline 5. En outre, bien que des progrès ont été réalisés dans la génération de lignées insulinome que mieux reproduits la réponse physiologique des îlots isolés au glucose (par exemple, l'INS-1 dérivé 832/13 et 832/3 lignées cellulaires), leur réactivité de glucose diffère encore de rat normal îlots 6,7. En outre, la réponse de ces lignées cellulaires d'insulinome clonalesde peptide-1 (GLP-1) des agonistes du glucagon-like peuvent différer considérablement les uns des autres, ainsi que de six îlots normaux. Par conséquent, les lignées cellulaires immortalisées peuvent ne pas représenter le meilleur modèle pour les agents de dosage ayant un impact sur la production d'AMPc.
Par contraste avec les lignées cellulaires dérivées insulinome, l'étude de la fonction β-cellulaire uniquement dans des modèles animaux entiers offre sa propre série de complications. Un des plus grands défis dans le travail avec le tissu endocrinien est de mesurer la concentration précise de l'hormone libérée. Plus précisément, le foie joue un rôle majeur métaboliser l'insuline, et le flux sanguin du pancréas va directement vers le foie. Ainsi, une mesure de l'insuline dans le plasma peut ne pas représenter avec précision les quantités d'insuline est sécrétée par le pancréas lui-même ou de l'incidence des différents traitements sur le taux de sécrétion de l'insuline 8. En outre, le métabolisme rénal de glucagon peut limiter la fiabilité de la production de glucagon par α-cellules d'îlots 9. Par conséquent, l'isolement d'îlots de souris primaires pour l'expérimentation in vitro fournit une compréhension plus précise de la façon dont l'îlot est de répondre à des stimuli spécifiques pour compléter les mesures effectuées in vivo.
Le présent protocole pour l'isolement des îlots de souris est un protocole bien établi utilisé par un certain nombre de groupes (avec de légères modifications qui peuvent aider à accroître la réussite) 10,11. En outre, la détermination de la production d'AMPc permet une lecture directe de la capacité de réponse des cellules incrétine-β. En conjonction avec la mesure de l'AMPc, la teneur en protéines et la sécrétion d'insuline peut également être quantifié à partir de la même préparation de l'échantillon de l'AMPc, aidant à déterminer si un défaut de la fonction β-cellule se trouve proximal ou distal par rapport à l'AMPc 10. La teneur en AMPc finale et l'insuline demande de sécrétion dans ce protocole peut être un outil très puissant pour comprendre l'influence des constituants pharmaceutiques et alimentaires, entre autres,s, sur l'AMPc et la sécrétion d'insuline. En plus de la stimulation de glucose seul, d'autres composés peuvent être utilisés pour mesurer les changements dans l'AMPc et la sécrétion d'insuline 10,11.
Enfin, bien que l'insuline est l'hormone principale nous dosage à partir de d'îlots isolés, d'autres hormones, telles que le glucagon et la somatostatine, ainsi que des cytokines, des eicosanoïdes, et l'adénosine monophosphate cyclique, peut également être mesuré, soit par un test de stimulation transitoire ou par quantification de leurs niveaux dans un milieu de culture 12. Enfin, bien que hors de la portée de ce manuscrit, l'isolement d'îlots avec le procédé d'isolement de la collagénase décrit permet une préservation des îlots de sorte que de nombreuses autres applications en aval peuvent être poursuivis, tels que la greffe d'îlots, l'isolement de l'ARN pour le temps réel de PCR quantitative ou microréseau analyses, protéine l'isolement de transfert de Western, îlot plongement et l'imagerie par immunofluorescence, et l'incorporation de [3H]-thymidine en tant que mesure de repli des cellules des îlotscation, dont certains ont été décrits dans les articles de JoVE précédentes 13 à 16. Dans l'ensemble, la suite de la procédure d'isolement des îlots décrite dans le protocole peut fournir un chercheur de l'information importante et utile pour le développement de thérapies et de promouvoir la découverte de médicaments visant à améliorer la fonction β-cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec la prévalence du diabète devrait affecter 7,7% de la population mondiale, l'exigence de nouvelles techniques de recherche est impératif à la fois comprendre et traiter le diabète 18. L'isolement des îlots présente est un protocole bien établi utilisés pour l'expérimentation in vitro et a été présenté précédemment, avec de légères modifications 11,14,16. Bien que la sécrétion d'insuline est une application en aval commun pour des îlots isolés, en s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Renée L. Pasker et Harpreet K. Brar pour l'assistance technique d'experts sur les protocoles décrits dans ce travail. En outre, nous tenons à remercier le mentorat de Christopher B. Newgard à l'Université Duke et Alan D. Attie à l'Université de Wisconsin-Madison, avec le soutien des membres de leur laboratoire, qui nous ont permis le temps et le soutien nécessaires pour optimiser la protocoles décrits. En particulier, nous remercions Hans Hohmeier, Danhong Lu, et Helena Winfield dans le laboratoire Newgard et Marie Rabaglia dans le laboratoire Attie pour des discussions et des conseils productifs. Ce travail a été soutenu par le NIH DK080845 de subvention et le diabète juvénile 594
Fondation de la recherche subvention 17-2011-608 (MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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