מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.
הגלוקוז לא מבוקר הוא סימן היכר של סוכרת ומקדם נלוות כמו נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה. עם השכיחות הגוברת של סוכרת, הן סוג החיסון בתיווך 1 וסוג 2 צמוד להשמנת יתר, מחקרים שמטרתם מגדירים הפתופיזיולוגיה סוכרת ומנגנונים טיפוליים הם בעלי חשיבות קריטית. Β-התאים של איי הלבלב לנגרהנס אחראים כראוי מפרישי אינסולין בתגובה לריכוז הגלוקוז בדם גבוה. בנוסף לגלוקוז וחומרים מזינים אחרים, β-התאים גם מגורה על ידי הורמונים מסוימים, כינה incretins, אשר מופרשים מהבטן בתגובה לארוחה ולפעול על קולטני β-תאים המגבירים את הייצור של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים ( cAMP). ירידה בתפקוד β-תא, מסה, ואת היענות אינקרטין הם הבינו היטב לתרום לפתופיזיולוגיה של סוכרת מסוג 2, וגם להיות מקושר יותר ויותר wiה סוכרת מסוג 1. הבידוד הנוכחי עכבר איון ופרוטוקול נחישות cAMP יכולים להיות כלי כדי לעזור להתוות מנגנוני קידום התקדמות מחלה והתערבויות טיפוליות, בעיקר אלה שמתווכים על ידי קולטנים אינקרטין או קשור קולטנים הפועלים באמצעות אפנון של ייצור cAMP תוך תאי. בעוד מדידות cAMP רק תתואר, פרוטוקול בידוד איון תאר יוצר הכנה נקייה שמאפשרת גם ליישומים רבים במורד הזרם אחרים, כוללים גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין, [3 H]-תימידין התאגדות, שפע חלבון, וביטוי mRNA.
התחזוקה הקפדנית של euglycemia היא הכרחית כדי למנוע נלוות כגון נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה, שהם כולם סימני ההיכר של פתולוגיה מסוג בלתי מבוקר 1 ו 2 סוכרת 1. פונקציה מופחתת β-תאים ומסה בשני מהסוג 1 וסוכרת 2 להפריע ריכוז הגלוקוז בדם 2. ואילו סוג החיסון בתיווך תוצאות 1 סוכרת מאובדן הרסני של β-תאים מייצרי אינסולין, הפרשה לקויה β-תאים לאינסולין ואינסולין איתות היקפית בסוכרת מסוג 2 יחד לקדם היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, וייצור הגלוקוז בכבד מוגבר, שסופו של דבר תוצאה הוא גם אובדן מסת β-תא והפרשת אינסולין מקיבולת β-תאים בודדים 3. הבנת מנגנוני β-תאי הבסיס בהתקדמות מסוג 1 וסוכרת 2 יהיה בתקווה להצמיח טיפולים חדשניים למניעה וטיפול במחלות אלה.
בti המבחנהמודלים תרבות ssue, כגון INS-1 וMIN6 הונצחו קווי β-תאים, יכולים להיות כלי שימושי להבנת פונקציות β-תאים ספציפיים. עם זאת, אינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך איון עשויים עצמם מווסתים את תפקוד β-תאים. לדוגמא, ההשפעה אוטוקריני של גלוקגון (שוחררה מα-תאים) וסומטוסטטין (שוחרר מδ-תאים) בהגדלת והקטנת הפרשת אינסולין, בהתאמה, מדגים את החשיבות של תא תא קירבה בתגובה האנדוקרינית 4. יתר על כן, צמתים פער בין β-תאים להגביר את שחרור אינסולין 5. יתר על כן, למרות שצעדים שנעשו ביצירת קווי insulinoma שיותר טוב לשכפל את התגובה הפיזיולוגית של איים מבודדים לגלוקוז (לדוגמא, INS-1 נגזר 832/13 ו832/3 שורות תאים), היענות הגלוקוז שלהם עדיין שונה מעכברים רגילים האיונים 6,7. יתר על כן, התגובה של שורות תאים אלה משובטים insulinomaלאגוניסטים כמו גלוקגון פפטיד -1 (GLP-1) יכולה להיות שונה באופן דרמטי מזה, כמו גם מאיונים רגילים 6. לכן, שורות תאים הונצחו לא יכולות לייצג את המודל הטוב ביותר למנסה לאמוד סוכנים המשפיעים על ייצור cAMP.
בניגוד לשורות תאי שמקורם בinsulinoma, לומד פונקצית β-תאים אך ורק במודלים של בעלי החיים כולו מציע סדרה של סיבוכים משלו. אחד האתגרים הגדולים ביותר בעבודה עם רקמה האנדוקרינית מודד את הריכוז המדויק של הורמון שפורסם. באופן ספציפי, הכבד ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים של אינסולין, וזרימת דם הלבלב הולכת ישירות אל הכבד. לפיכך, מדידת אינסולין בפלזמה לא יכולה לתאר במדויק את כמויות אינסולין שמופרשות מהלבלב עצמו או את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעור הפרשת אינסולין 8. יתר על כן, חילוף חומרים של כליות של גלוקגון עלול להגביל את מהימנות פלט גלוקגון מהאיון α-תאים 9. לכן, בידוד איונים עכבר עיקריים לניסויים במבחנה מספק הבנה מדויקת יותר של אופן שבו איון מגיב לגירויים ספציפיים כדי להשלים את המדידות שנעשו בגוף חי.
הפרוטוקול הנוכחי לבידוד של איי עכבר הוא פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש על ידי מספר הקבוצות (עם שינויים קלים שעשויות לעזור כדי להגדיל את ההצלחה) 10,11. בנוסף, קביעת ייצור cAMP מאפשרת קריאה מתוך ישירה של היענות אינקרטין של β-התאים. בשילוב עם מדידת cAMP, תכולת חלבון והפרשת אינסולין גם ניתן לכמת מאותו מכין מדגם cAMP, עוזר לקבוע אם פגם בתפקודו β-תאים טמון פרוקסימלי או דיסטלי למחנה 10. התוכן הסופי cAMP ויישום הפרשת אינסולין בפרוטוקול זה יכול להיות כלי רב עוצמה להבנת ההשפעה של מרכיבי תרופות ומזון, בין השארים, על מחנה והפרשת אינסולין. בנוסף לגירוי מגלוקוז לבד, יכולה להיות בשימוש תרכובות אחרות כדי למדוד שינויים במחנה והפרשת אינסולין 10,11.
לבסוף, למרות שהאינסולין הוא ההורמון העיקרי שאנחנו assay מאיים מבודדים, הורמונים אחרים, כגון גלוקגון וסומטוסטטין, כמו גם ציטוקינים, eicosanoids, וmonophosphate אדנוזין המחזורי, ניתן גם למדוד, או על ידי assay גירוי חולף או על ידי כימות הרמות שלהם במדיום תרבות 12. לבסוף, למרות שמחוץ לתחום של כתב היד הזה, בידוד איון עם שיטת בידוד collagenase תאר מאפשר לשימור איון, כך שיישומים רבים אחרים במורד הזרם עשויים להיות נרדפים, כגון השתלת איון, בידוד RNA בזמן אמת PCR כמוני או microarray מנתח, חלבון בידוד מערבי סופג, הטבעת איון וההדמיה immunofluorescent, ושילוב [3H]-תימידין כמדד לrepli תא איוןקטיון, שחלקם כבר תאר במאמרי יופיטר הקודמים 13-16. בסך הכל, בעקבות הליך בידוד איון שתואר בפרוטוקול עשוי לספק חוקר עם מידע חשוב ושימושי לפיתוח טיפולים וקידום גילוי תרופות שמטרתן שיפור תפקוד β-תאים.
עם השכיחות של הסוכרת צפויה להשפיע 7.7% מאוכלוסיית העולם, הדרישה של טכניקות מחקר רומן הכרחית לשניהם להבין ולטפל בסוכרת 18. בידוד איון הנוכחי הוא פרוטוקול מבוסס היטב המשמש לניסויים במבחנה וכבר הוצג בעבר עם 11,14,16 שינויים קלים. למרות שהפרשת אינסולין היא ייש…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לרנה ל Pasker וHarpreet ק Brar לקבלת סיוע טכני מומחה לפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו. יתר על כן, ברצוננו להכיר בחונכות של כריסטופר ב Newgard באוניברסיטת דיוק ואלן ד איתי באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון, יחד עם התמיכה של חברי המעבדה שלהם, שאפשרו לנו את הזמן ואת התמיכה הנדרשת כדי למטב פרוטוקולים שתוארו. בפרט, אנו מודים לאנס Hohmeier, Danhong לו, והלנה וינפילד במעבדה Newgard ומרי Rabaglia במעבדה איתי לדיונים ועצות מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080845 וסוכרת נעורים 594
מענק קרן מחקר 17-2011-608 (לMEK)
Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
1ml BD syringe | BD | 309628 |
30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |