Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.
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Artigo de método
Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.
Introdução
A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes 1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue 2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por re....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC), da Universidade de Wisconsin-Madison.
1. Preparação de Soluções
- O método de eutanásia neste protocolo é sangria sob anestesia Avertin (para uma revisão de alternativas, ver Discussão). Para fazer Avertin, adicionar 0,625 g (1,25% ou 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoetanol a 1,25 ml de 2-metil-2-butanol em um tubo de 15 ml e aquece-se a 37 ° C durante 20-30 min. Vortex a solução....
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Resultados
Para garantir um alto rendimento ilhota durante o isolamento, as técnicas cirúrgicas descritas no protocolo deve ser seguido de perto. Embora as técnicas apresentadas aqui vai ser adaptado para cada laboratório, existem alguns passos críticos que levarão a um isolamento bem sucedido. A fim de tornar o canal biliar comum de fácil acesso, recomenda-se que os órgãos de ser deslocado para o lado direito do rato (Figura 1). Além disso, isto irá permitir que o pâncreas são accionados com uma quantidade menor .......
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Discussão
Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes 18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações 11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais como cAMP, pode.......
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Divulgações
Autores têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar para assistência técnica especializada sobre os protocolos descritos neste trabalho. Além disso, gostaríamos de reconhecer a orientação de Christopher B. Newgard na Duke University e Alan D. Attie na Universidade de Wisconsin-Madison, juntamente com o apoio de seus membros de laboratório, o que nos permitiu a tempo e apoio necessários para otimizar o protocolos descritos. Em particular, agradecemos Hans Hohmeier, Danhong Lu, e Helena Winfield no Laboratório Newgard e Maria Rabaglia no Laboratório Attie para discussões produtivas e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo NIH DK080845 concessão e diabet....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Colagenase de Clostridium histolyticum adequada para isolar ilhotas ativas | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Solução salina balanceada 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (pó) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 Fio de Sutura de Seda | Ferramentas Fine Science | 18020-30 | |
| Dumont #5 Pinça | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pinça de 0,8 mm | Ferramentas de Ciência Fina | 11050-10 | |
| Tesoura Curvada | Ferramentas de Ciência Fina | 14061-10 | |
| Vannas-Tü bingen Tesoura de Mola - Reta/Afiada/8,5 cm/5 mm Ponta | Ferramentas de Ciência Fina | 15003-08 | |
| Tesoura de Dissecção | Ferramentas de Ciência Fina | 14002-14 | |
| ml BD Seringa Luer-Lok | BD | 309646 | |
| Seringa BD de 1 ml | BD | 309628 | |
| 30 G BD Agulha 1/2" Comprimento | BD | 305106 | |
| 27 G BD Agulha 1/2" Comprimento | BD | 305109 | |
| Pedra de Afiar | Ferramentas de Belas Costuras | 29008-01 | |
| 2-2-2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-metil-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Cloreto de Sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cloreto de Potássio | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Fosfato monopotássico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Bicarbonato de sódio (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| Soro Bovino Fetal Inativado por Calor (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Referências
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
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Reimpressões e permissões
