Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação
Summary
Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.
Abstract
Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.
Introduction
A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes 1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue 2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por resultar em tanto a perda da capacidade de destruição de células β e secreção de insulina a partir de células individuais β-3. Compreender os mecanismos de células-β subjacentes a progressão da diabetes tipo 1 e 2, esperamos dar origem a novas terapias para prevenir e tratar estas doenças.
In vitro timodelos de cultura ssue, tais como o INS-1 e MIN6 linhas de células imortalizadas β, podem ser ferramentas úteis para a compreensão da função das células β específicos. No entanto, as interações entre os diferentes tipos de células dentro da ilhota-se pode regular a função das células β. Por exemplo, a influência parácrina de glucagon (libertado a partir de células-α) e somatostatina (libertado a partir de células-δ) em aumentar e diminuir a secreção de insulina, respectivamente, demonstra a importância da proximidade de células de células na resposta endócrina 4. Além disso, junções entre as células-β potencializar a liberação de insulina 5. Além disso, embora tenham sido feitos progressos na geração de linhas de insulinoma que melhor replicados a resposta fisiológica de ilhéus isolados de glicose (por exemplo, o INS-1 derivado de 832/13 e 832/3 linhas de células), a sua capacidade de resposta de glucose ainda difere do normal de rato ilhotas 6,7. Além disso, a resposta destas linhas celulares de insulinoma clonaisa peptide-1 (GLP-1) agonistas de glucagon-like pode variar drasticamente de uma outra, bem como a partir de ilhéus normais 6. Portanto, as linhas de células imortalizadas podem não representar o melhor modelo para os agentes de ensaio que o impacto sobre a produção de cAMP.
Em contraste com as linhas de células derivadas de insulinoma, estudar a função das células β exclusivamente em modelos animais completos oferece o seu próprio conjunto de complicações. Um dos maiores desafios no trabalho com tecido endócrino está medindo a concentração precisa de hormônio liberado. Especificamente, o fígado desempenha um papel importante metabolizar a insulina, e o fluxo de sangue pâncreas vai directamente para o fígado. Assim, uma medição de insulina no plasma podem não descrever com precisão a quantidade de insulina a ser segregadas a partir da própria pâncreas ou o impacto de diferentes tratamentos sobre a taxa de secreção de insulina 8. Além disso, o metabolismo renal do glucagon pode limitar a confiabilidade da produção de glucagon a partir de células dos ilhéus α-9. Portanto, isolar ilhotas principal do mouse para a experimentação in vitro proporciona uma compreensão mais precisa de como a ilhota está respondendo a estímulos específicos para complementar as medições feitas in vivo.
O presente protocolo para o isolamento de ilhotas de rato é um protocolo bem estabelecido usado por um número de grupos (com pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso) 10,11. Além disso, a determinação da produção de cAMP permite uma leitura directa da capacidade de resposta das células incretina-β. Em conjunção com a medição de cAMP, teor de proteína e a secreção de insulina pode também ser quantificada a partir da mesma preparação de amostras de cAMP, ajudando a determinar se um defeito na função das células-β reside proximal ou distal em AMPc 10. O conteúdo cAMP final e aplicação da secreção de insulina neste protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa para a compreensão da influência de componentes farmacêuticos e dietéticos, entre outross, em cAMP e secreção de insulina. Além disso a estimulação da glucose sozinha, outros compostos podem ser utilizados para medir as alterações do cAMP e secreção de insulina 10,11.
Finalmente, embora a insulina é a hormona primária que ensaiar a partir de ilhotas isoladas, outras hormonas, como o glucagon e somatostatina, assim como citoquinas, e eicosanóides, o monofosfato cíclico de adenosina, pode também ser medida, quer por um ensaio de estimulação transitória ou por quantificação de os seus níveis no meio de cultura 12. Finalmente, embora fora do âmbito deste manuscrito, isolamento de ilhotas com o método de isolamento da colagenase descrita permite a preservação da ilhota de forma que muitas outras aplicações a jusante, pode ser exercida, tal como o transplante de ilhotas, para isolamento de RNA por PCR quantitativo em tempo real ou de microarray análises de proteínas isolamento por Western blot, dos ilhéus incorporação e imagiologia de imunofluorescência, e incorporação de [3H]-timidina como medida de repli antiilhotascação, alguns dos quais têm sido descritas em artigos anteriores JoVE 13-16. No geral, seguindo o procedimento de isolamento das ilhotas descritos no protocolo pode fornecer um pesquisador com informações importantes e úteis para o desenvolvimento de terapias e promover a descoberta de medicamentos destinado a melhorar a função das células β.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes 18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações 11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar para assistência técnica especializada sobre os protocolos descritos neste trabalho. Além disso, gostaríamos de reconhecer a orientação de Christopher B. Newgard na Duke University e Alan D. Attie na Universidade de Wisconsin-Madison, juntamente com o apoio de seus membros de laboratório, o que nos permitiu a tempo e apoio necessários para otimizar o protocolos descritos. Em particular, agradecemos Hans Hohmeier, Danhong Lu, e Helena Winfield no Laboratório Newgard e Maria Rabaglia no Laboratório Attie para discussões produtivas e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo NIH DK080845 concessão e diabetes juvenil 594
Fundação de Pesquisa de concessão 17-2011-608 (a MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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