قياس الافراج عن التوتر أثناء المستحثة بالليزر اكسون الآفات لتقييم التصاق محور عصبي إلى الركيزة في Piconewton والقرار ملي
Summary
قمنا بقياس الافراج عن التوتر في محور عصبي التي تم lesioned جزئيا مع مشرح ليزر من قبل في وقت واحد القياس الطيفي قوة أجريت على اجراء تحقيق بصريا-المحاصرين انضمت إلى غشاء من محور عصبي. بروتوكول التجريبية المتقدمة بتقييم التصاق محوار إلى الركيزة الثقافة.
Abstract
ويتأثر تشكيل اتصالات وظيفية في شبكة الخلايا العصبية النامية من خلال اشارات خارجية. هو نمو محوار من الخلايا العصبية النامية عرضة للإشارات الكيميائية والميكانيكية، والآليات التي الحواس ويستجيب لإشارات الميكانيكية غير مفهومة جيدا. سوف توضيح دور القوات في نضوج الخلية تمكين تصميم السقالات التي يمكن أن تعزز التصاق الخلايا واقتران هيكل الخلية إلى الركيزة، وبالتالي تحسين قدرة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة لتجديد بعد الاصابة.
هنا، نحن تصف طريقة لتطبيق في وقت واحد قياسات التحليل الطيفي خلال قوة الليزر التي يسببها الآفة الخلية. نقيس الافراج عن التوتر في محور عصبي lesioned جزئيا من خلال تتبع التداخل في وقت واحد من اجراء تحقيق المحاصرين بصريا انضمت إلى غشاء من محور عصبي. لدينا بروتوكول تجريبي بالكشف عن الافراج عن التوتر مع piconewton حساسية، والديناميكية لإطلاق سراح التوتر فيالقرار وقت ميلي ثانية واحدة. ولذلك، فإنه يوفر وسيلة عالية الدقة لدراسة كيفية اقتران الميكانيكية بين الخلايا وركائز يمكن أن يكون عن طريق التضمين العلاج الدوائي و / أو عن طريق الخواص الميكانيكية متميزة من الركيزة.
Introduction
المجهر الضوئي هو واحد من نظام التصوير أقل الغازية المتاحة لمراقبة الخلايا الحية. مع استغلال تأثيرات مثل ضغط الإشعاع (كما في ملاقط بصرية 1)، أو ذات الطاقة العالية تدفق الفوتون (كما هو الحال في الليزر مشرح 2)، تم تمديد هذه التكنولوجيا لنانو التلاعب. نظام التصوير الضوئي وتقدم لمراقبة دقيقة لتصور والتلاعب أهداف الخلوية الفرعية 3. في الوقت نفسه، وذلك بفضل لمعايرة دقيقة من قوة الليزر تسليمها، أدوات بصرية إنجاز إما لينة أو الغازية التلاعب عينة مع استنساخ لم يسبق لها مثيل.
عدة مختبرات متكاملة، في نفس الإعداد التجريبية، ملاقط بصرية ومشرح الليزر ليجتذ العضيات 4، لتلتحم مع بعضها خلايا مختلفة 5، أو لتحفيز الخلايا عن طريق مدفوعة بصريا الشحنات 6،7. بينما ملاقط بصرية، بعد معايرة لصلابة البصرية، تسمح للسيطرة القوة المطبقة على الخلية على نطاق piconewton، ويمكن لنظم تشريح الليزر تعدل التلاعب البصرية، والتي تتراوح من غشاء الصور poration إلى الاجتثاث من العضيات واحد أو تشريح هياكل شبه الخلوية. ومع ذلك، يعتمد الليزر معايرة تشريح على التقييم النوعي للكيان من التلاعب البصرية فيما يتعلق الطاقة تسليمها إلى عينة، تقوم أساسا على تحليل الصور التي توضح التغيرات المورفولوجية التي لحقت عينة 8. في الطريقة المعروضة، ونحن لشرح كيفية تنفيذ القياس الطيفي قوة أثناء تشريح محور عصبي الليزر من الخلايا العصبية النامية، على القياس، وعلى نطاق وpiconewton، القوة التي ينتجها التوازن تغير في بنية الهيكل الخلوي من حجرة شبه الخلوية 9. الخلايا العصبية مثقف التمسك الركيزة، واستقطاب خلال التنمية. وتحدث هذه المرحلة الاستقطاب خلال الأيام الخمسة الأولى في المختبر. في المرحلة الثانية من الاستقطاب، واحدة من extrudneurites التي جي يصبح أطول، وأنها سوف تفرق أن تصبح محور عصبي 10. استطالة محور عصبي ردا على قوة سحب في مخروط النمو قد صيغت من قبل نموذج Dennerl في 11. في الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد هذا النموذج ليشمل 12 دور التصاق محوار إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. وأظهر هذا النموذج الفيزيائية الحيوية، اقترح بعد الملاحظات التجريبية 13، أن سحب القوات على مخروط النمو، نشر على طول محوار، هي عن طريق التضمين الالتصاقات البؤرية إلى الركيزة. وبالمثل، آفة محور عصبي ينتج الافراج المحلية من التوتر نشر نحو خلايا الجسم. وبالتالي، اقترحنا أن قياس مثل التوتر الذي صدر في مكان على طول محور عصبي بين الآفة وسوما الخلية توفر إمكانية لتقييم نتائج الملطف من الالتصاقات البؤرية تتأثر.
نحن معايرة اللازمة طاقة الفوتون-الجريان للمشرح ليزر للتحكم في مدى ل damag محور عصبي ألحقته، من عانى من قطع كامل للآفة جزئية. بعد المعايرة، كررنا آفة جزئية إلى محاور عصبية من الخلايا العصبية عدة التفريق وضعت بروتوكول لقياس الافراج عن التوتر، وبالتالي الحصول على معلمة الكمي لتقدير التصاق من محور عصبي إلى الركيزة 14.
في العمل الحالي، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول المتقدمة، وهو ما يمثل الإجراء التجريبي دقيقة لتقييم ومقارنة مع piconewton حساسية الالتصاق محور عصبي إلى الركيزة في ظروف تجريبية مختلفة مثل المعالجة الكيميائية 14، أو أنواع مختلفة من الدعم ثقافة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نفيدكم في هذا العمل أسلوب كمي لمقارنة التصاق محوار إلى الركيزة ثقافة، في وقت واحد عن طريق إجراء القياس الطيفي قوة الليزر خلال الناجم عن آفة الخلية. ويرتبط الإفراج قياس التوتر لدرجة التصاق الخلية إلى الركيزة: يجب أن الخلايا تحتوي على عدد أكبر من الالتصاقات البؤرية ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البرتو Guiggiani لتطوير نظام مراقبة الوقت الحقيقي، إيفيلينا Chieregatti وهانكو تسوشيما للمناقشات بصيرة، جياكومو Pruzzo واليساندرو بارودي لتطوير الالكترونيات والبرمجيات المخصصة، وكلوديا Chiabrera ومارينا ناني عن مشورة الخبراء والمساعدة في إعداد ثقافة الخلية.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Referências
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
