מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.
היווצרות של קשרים פונקציונליים עצבית ברשת פיתוח מושפעת על ידי רמזים חיצוניים. צמיחת neurite של נוירונים מתפתחים כפופה לאותות כימיים ומכאניים, והמנגנונים שבאמצעותם הוא חש ומגיב לאותות מכאניים הם הבינו היטב. הבהרת תפקידם של כוחות בהתבגרות תא תאפשר את העיצוב של פיגומים שיכולים לקדם את הידבקות תא וצימוד cytoskeletal למצע, ולכן לשפר את היכולת של סוגים שונים עצביים להתחדש לאחר פציעה.
כאן, אנו מתארים שיטה ליישם מדידות ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. אנו מודדים את שחרור מתח באקסון באופן חלקי על ידי מעקב lesioned interferometric סימולטני של חללית לכודה אופטי דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי שלנו מזהה את שחרור המתח עם רגישות piconewton, והדינמיקה של שחרור המתח ברזולוציה זמן אלפית השנייה. לכן, היא מציעה שיטת רזולוציה גבוהה ללמוד איך הצימוד מכאני בין תאים ומצעים יכול להיות מווסת על ידי טיפול תרופתי ו / או על ידי תכונות מכאניות שונות של המצע.
מיקרוסקופיה אופטית היא אחד ממערכת ההדמיה פחות פולשנית זמינה להתבונן תאי חיים. עם הניצול של תופעות כגון לחץ קרינה (כמו בפינצטה האופטית 1), או שטף פוטונים באנרגיה גבוהה (כמו בליזר המבתר 2), טכנולוגיה זו הוארכה עד ננו מניפולציה. מערכת ההדמיה האופטית מספקת שליטה מדויקת לדמיין ולתפעל מטרות הסלולר משנה 3. באותו הזמן, הודות לכיול מדויק של כוח לייזר נמסר, כלים אופטיים להשיג או מניפולציה מדגם רכה או פולשני עם שחזור חסר תקדים.
מספר מעבדות משולבות, באותה הגדרת ניסוי, פינצטה אופטית וליזר מבתר כדי לקטוע האברונים 4, לפתיל יחד 5 תאים שונים, או כדי לעורר את התאים על ידי מטענים מונעים אופטי 6,7. בעוד פינצטה אופטית, לאחר כיול של הקשיחות האופטית, תאפשרהשליטה הפעיל כוח לתא בקנה מידת piconewton, מערכות לייזר לנתיחה יכולה לווסת את המניפולציה אופטית, שנעה בין קרום צילום poration לאבלציה של אברונים או נתיחה בודדות של מבנים תת סלולריים. עם זאת, כיול נתיחת לייזר מסתמך על הערכה איכותית של הישות של מניפולציה אופטית ביחס לאנרגיה שנמסרה למדגם, המבוססת בעיקר על ניתוח תמונה הממחיש את השינויים מורפולוגיים שנגרמו לדגימת 8. בשיטה שהוצגה, אנו מדגימים כיצד לבצע מדידת ספקטרוסקופיה תוקף במהלך נתיחת axonal לייזר של נוירון פיתוח, לכמת, בקנה מידת piconewton, הכח הנוצר על ידי שיווי משקל משתנה במבנה שלד התא של תא משנה הסלולר 9. נוירונים בתרבית לדבוק במצע, ולקטב במהלך פיתוח. שלב הקיטוב מתרחש במהלך חמשת הימים הראשונים במבחנה. בשלב שתיים של קיטוב, אחד extrudneurites ing הופך ארוך יותר, וזה יהיה להבדיל להפוך האקסון 10. התארכות axonal בתגובה לכוח הגרירה בחרוט הצמיחה כבר דגם בעבר על ידי המודל של Dennerl 11. לאחרונה, מודל זה הורחב כדי לכלול 12 את התפקיד של הידבקות neurite למצעי מטריקס. מודל biophysical זו, מוצע לאחר תצפיות ניסיוניות 13, הראה כי משיכת כוחות על חרוט צמיחה, מתפשטת לאורך neurite, הם מווסת על ידי הידבקויות מוקד למצע. כמו כן, נגע axonal מייצר שחרור מקומי של מתח מתפשט לכיוון גוף התא. לפיכך, אנו מציעים כי מדידת מתח שוחרר כזו במיקום לאורך האקסון בין הנגע וסומה התא מציעה את האפשרות להעריך את סיכויי הריסון של הידבקויות מוקד שלא נפגעו.
אנו מכיילים את האנרגיה הדרושה פוטון-השטף של מבתר לייזר כדי לשלוט על היקף damag axonal נגרמהדואר, מחיתוך רוחב מלא לנגע חלקי. בעקבות הכיול, אנחנו חזרתי באופן חלקי לנגע את האקסונים של תאי עצב כמה מבדילים ופיתח את הפרוטוקול לכמת את שחרור המתח, וקיבל פרמטר הכמותי לאמוד את ההידבקות של האקסון למצע ובכך 14.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול פיתחה, המייצג את הליך ניסוי מדויק כדי להעריך ולהשוות עם רגישות piconewton הידבקות axonal למצע בתנאים שונים ניסיוניים כגון טיפול כימי 14, או סוגים שונים של תמיכת תרבית תאים.
אנו מדווחים בעבודה זו שיטה כמותית להשוואת הידבקות neurite למצע התרבות, על ידי ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. שחרורו נמדד מתח קשור למידת ההדבקה של התא למצע: תאים עם מספר גבוה יותר של הידבקויות מוקד צריכים לשחרר פחות מתח. מדידת שחרור המתח במונחי?…
The authors have nothing to disclose.
אלברטו Guiggiani לפיתוח מערכת הבקרה בזמן אמת, אוולינה Chieregatti וHanako צושימה לדיוני תובנה, ג'אקומו Pruzzo ואלסנדרו פארודי לפיתוח אלקטרוניקה ותוכנה מותאמות אישית, וקלאודיה Chiabrera ומרינת נאני לייעוץ המקצועי שלהם וסיוע בהכנת תרבית תאים.
REAGENTS | |||
Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
EQUIPMENT | |||
IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |