השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em> דרוזופילה</em> בידוד זקיק
Summary
בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.
Abstract
oogenesis דרוזופילה או התפתחות זקיק כבר בשימוש נרחב על מנת לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים התפתחותית ותא מורכבים. נייר שיטות זה מתאר כיצד לבודד זקיקי האמצע לסוף שלב (שלב 10B-14) ולנצל אותם על מנת לספק תובנות חדשות על האירועים המולקולריים ומורפולוגיים המתרחשים במהלך חלונות הדוקים של זמן התפתחותי. זקיקים מבודדים יכולים לשמש למגוון רחב של טכניקות ניסוי, כוללים במבחני חוץ גופית פיתוח, הדמיה לחיות, ניתוח ביטוי mRNA וניתוח כתם המערבי של חלבונים. זקיקים בשלב 10B (S10B) או במאוחר יהיו להשלים את הפיתוח בתרבות, זה מאפשר לשלב הפרעות גנטיות או תרופתיות עם פיתוח במבחנה כדי להגדיר את ההשפעות של מניפולציות כאלה על התהליכים המתרחשים בתקופות מסוימות של התפתחות. בנוסף, משום שזקיקים אלה מפתחים בתרבות, הם מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה חיות, אשר לעתים קרובות לחשוף את המנגנונים חדשים שלתווך אירועים מורפולוגיים. גם זקיקים מבודדים יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים. לדוגמא, שינויים בביטוי הגנים הנובעים מהפרעות גנטיות יכולים להיות מוגדרים עבור חלונות התפתחותיים ספציפית. בנוסף, רמת חלבון, יציבות, ו / או שינוי מצב posttranslational בשלב מסוים של התפתחות זקיק ניתן לבחון באמצעות כתם מערבי מנתח. לפיכך, בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה מספק מקור מידע עשיר לתהליכי שימור נרחב של פיתוח והמורפוגנזה.
Introduction
כל השחלה דרוזופילה מורכבת מ~ 16V ovarioles, או רשתות של תאי ביצה ברצף התבגרות או זקיקים. כל זקיק מורכב מביצית אחת, תאי אחות או תמיכה נגזרים שורת נבט 15, ו~ 650 תאים סומטיים מכונים תאי זקיק (איור 1 א). Oogenesis דרוזופילה מחולק ל14 שלבים מוגדרים מורפולוגית של פיתוח 1. בכל שלב של התפתחות זקיק הוא ציין פעמים רבות בתוך זבוב אחד, ולכן קל יחסית לבודד מספר ניכר של זקיקים בשלב מסוים.
שלבי האמצע עד סוף של oogenesis (שלבי 10B-14) הם גם מתאימים במיוחד לבידוד במה (איור 1). בשלב 10B (S10B), הזקיק מוארך באופן מלא (כלומר אורכו שווה לזה של שלב 14 (זקיק S14), ראה איור 1 ואיור 2H) ומחצית מאורכו של הזקיק מורכב מתאי אחותואילו המחצית השנייה היא הביצית (איור 1 ג). בשלב זה תאי האחות עוברים שיפוץ אקטין דרמטי, חיזוק אקטין קליפת המוח ויצירת חבילות מקבילות של סיבי אקטין 2. במקביל, אוכלוסייה של תאי זקיק, המכונה תאים הצנטריפטלי, נודדים בין תאי האחות והביצית, ושתי קבוצות הגבי של תאי זקיק הופכות צוינו לעבור הגירה כדי ליצור את הנספחים הגבי, מנגנוני נשימה צינורי לעובר 3 . תאי האחות אז חוזה (S11), לוחץ תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית בתהליך הנקרא תא אחות השלכת, אשר מספק את הביצית עם הגורמים הדרושים לכך שכדי להשלים את העובר (1D איור). תאי האחות ואז לעבור תא מוות (S12-S13) 4, ותאי הזקיק מפרישים ודפוס קליפת הביצה 5 (האיורים 1E-G). לפיכך, בסוף oogenesis עשיר בהתפתחותיים חשובתהליכי morphogenetic ד.
זקיקים מבודדים באמצע בשלב מאוחר (S10B-S14) יכולים לשמש למגוון מטרות, כולל ניתוחים מולקולריים. לדוגמא, ה-mRNA מזקיקים מבוימים יכולה להיות מבודד לRT-PCR, microarray, או RNA-seq ניתוחים. זה מאפשר להסתכל על ביטוי גנים בתוך חלון התפתחותית קצר, עם רק כמה סוגי תאים בהווה, ולקבוע כיצד ביטוי גנים שונה על ידי הפרעות או תרופתיות או גנטיות. גם בידוד שלב ניתן להשתמש להסתכל על חלבונים על ידי מערבי סופג. ניתוח כזה הוא חשוב משום שהוא מאפשר לכמת את רמת ביטוי החלבון בwild-type לעומת מוטציות בשלבים מסוימים. אמנם אפשר להשתמש immunofluorescent מנתח כדי להשיג תוצאות דומות, כימות של הקרינה היא חזקה פחות בשל הדרישות הקפדניות שכל הפיקסלים יהיו בתחום ליניארי של זיהוי 6. בנוסף, ניתוח כתם מערבי עשוי לספק מידע אחר, כגוןים אם החלבון הוא שונה או שהוא בא לידי ביטוי מאיזופורם אחו ספציפי posttranslationally. גם שלבים מבודדים יכולים לשמש לטיהור חלבונים נוספת, כוללים חלוקה או coimmunoprecipitation subcellular.
גם בידוד זקיק בשלב מסוים יכול לשמש במבחני חוץ גופית פיתוח 7 וחייה הדמיה 8. זקיקי S10B-S13 מבודדים ימשיכו לפתח לS14 בתקשורת תרבות הפשוטה (ראה להלן). חשוב לציין כי זקיקי S10A לא להתקדם דרך תא אחות השלכת באמצעות תנאי התרבות שנדונו בכתב היד הזה. יש לנו בשימוש במבחני חוץ גופית פיתוח S10B להגדיר את התפקיד של פרוסטגלנדינים, שני פרמקולוגית וגנטי, בויסות שיפוץ אקטין באמצעות תא אחות השלכת ופיתוח לקריאה פסקי 7,9. בדומה לכך, בשלבים מאוחר יותר של התפתחות יכולים גם להיות מבודדים כדי לקבוע את ההשפעות של טיפולים תרופתיים או איש גנטיipulations על תהליכים מסוימים, כגון הגירה הצנטריפטלי תא, הגירת תוספת גב / היווצרות 10, ומוות של תאי אחות. מבחני מסוג זה יכול לשמש כדי לבצע מסכי אינטראקציה דומיננטיים או מבחני, למשל, בעוד heterozygosity למוטציות בPXT או fascin לבד אין להם השפעה על התפתחות S10B במבחנה, זקיקים מheterozygotes הכפול תא אחות תערוכת הטלת מומים ולחסום בפיתוח 9.
בנוסף, בגלל S10B-13 יכולים להתפתח בתרבות, כל התהליכים המתרחשים בתקופה זו ניתן לצפות בזמן אמת הדמיה. הדמיה כזו יכולה להתבצע רק באמצעות אור מועבר (אם הוא מעוניין רק בשינויים במורפולוגיה ברוטו) או עם מיקרוסקופיה confocal באמצעות זבובים מהונדסים מבטא בדיקות או זקיקים מוכתמים בצבעי ניאון הדמיה לחיות. הדמיה חיה נמצאת בשימוש כדי לקדם את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו באופן משמעותי. אכן, לחיות לדמייןגרם של זקיקים בשלב מאוחר הרחיב את הידע של הגירת תוספת גב, דוגמא של tubulogenesis 10. אנו מצפים כי הדמיה חיה של תהליכים נוספים בשלב מאוחר, ובכלל זה אקטין דינמיקה בתא אחות השלכת, תספק תובנה חדשות אירועים התפתחותיים אלה. חשוב לציין כי בעוד S10A ושל התפתחות זקיק בשלבים מוקדמים לא ימשיכו להתפתח S14 בתרבות, בשידור חי הדמיה של אירועים המתרחשים באותם שלבים של התפתחות אפשרית באמצעות תנאי תרבות אלטרנטיביים 11-14 (ראה דיון ליותר מידע).
כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבידוד זקיקים בשלב מאוחר גם עבור פיתוח במבחנה ולחיות הדמיה, או ניתוחים מולקולריים (mRNA ובידוד חלבון).
Protocol
Representative Results
Discussion
זקיק דרוזופילה מורכב ממספר קטן של סוגי תאים, מה שהופך אותו אידיאלי עבור שניהם המורפולוגיים וניתוחים מולקולריים. יתר על כן, בשל המבנה של השחלה, קל יחסית להשיג מספר גדול של שלבים מסוימים של התפתחות זקיק עם היקף ניתוחים נפוץ והכשרה מינימאלית. כמו כל שלב מייצג חלון ז?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לתומאס Lecuit (קו GFP :: sqh-Utrophin), מרכז מלאי בלומינגטון, ובנק Hybridoma המחקרים התפתחותית לחומרים כימיים. בנוסף, אנו מודים לכל חברי המעבדה צפר לדיונים וביקורת מועילים של כתב היד. מימון מהקרן הלאומי למדע MCB-1158527, וקרנות הזנק מאנטומיה ומחלקת ביולוגיה של תא, אוניברסיטת איווה תמכו עבודה זו. המכון הלאומי לבריאות predoctoral הדרכה גרנט בתרופתי המדעים T32GM067795 נתמך AJS. תמיכת אחסון נתונים סופקה על ידי ICTS, אשר ממומן באמצעות CTSA נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, המכונים הלאומיים לבריאות, דרך גרנט UL1RR024979.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Referências
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genética. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
