En känslig metod för att kvantifiera senescenta cancerceller
Summary
Vare senescence förhindrar eller främjar tumörbildning förblir kontroversiell. Eftersom chemotherapeutical droger kan framkalla cancerceller att senesce, studera åldrande är viktigt för att föreslå nya terapier. Presenterar emellertid standard och välanvända β-galaktosidas-analysen stora nackdelar. Vi föreslår här en snabb och känslig flödescytometri-baserad analys för att kvantifiera senescens.
Abstract
Mänskliga celler inte på obestämd tid föröka sig. Vid externa och / eller inneboende ledtrådar, kan celler dör eller ange en stabil cellcykelstopp kallas åldrande. Flera cellulära mekanismer, såsom telomerförkortning och onormalt uttryck av mitogena onkogener, har visat sig orsaka åldrande. Åldrande är inte begränsad till normala celler, cancerceller har också rapporterats att senesce.
Chemotherapeutical läkemedel har visats inducera åldrande i cancerceller. Det är dock fortfarande kontroversiellt om åldrande hindrar eller främjar tumörbildning. Eftersom det kan så småningom vara patient-specifika, kommer en snabb och känslig metod för att bedöma senescence i cancercellen snart krävas.
För detta ändamål uppvisar den vanliga β-galaktosidas-analysen, det för närvarande använda metoden, stora nackdelar: det är tidskrävande och inte känsliga. Vi föreslår här en flödescytometri-baserad analys för att studera åldrande på live celler. Denna analys erbjuder fördelen av att vara snabb, känslig och kan vara kopplat till immunomärkning av olika cellulära markörer.
Introduction
Sedan början av sextiotalet och dess upptäckt av Hayflick och Moorhead, återstår senescence fortfarande en cellulär nyfikenhet 1. Mänskliga celler inte på obestämd tid föröka sig och genom åldrande, Hayflick och Moorhead myntade cellulära åldrandet. Åldrande är ett stabilt cellcykelstopp vid vilka celler förblir metaboliskt aktiva i motsats till celldöd. Hittills har fyra cellulära mekanismer visats inducera åldrande: telomerförkortning, DNA-skador, kromatin störning, och onormalt uttryck av mitogena onkogener 2. Detta tyder inte bara på normala celler men också cancerceller kan genomgå åldrande 3. I själva verket var cancerceller genomgår senescence visat sig utgöra ett hinder för att ytterligare tumörprogression 4-5. Dock har flera rapporter pekat nu att, under vissa omständigheter, kan cellulärt åldrande också främja malignitet 6-7. Studera åldrande av cancer CELls är på väg att bli en längtan inom cancerforskning som för närvarande används cellgifter kan leda till åldrande av cancerceller inte bara in vitro utan också in vivo 8.
Det stora analys för att undersöka med avseende på närvaro av åldrande celler är β-galaktosidas-analysen vid surt pH. Denna histokemisk analys avspeglar ökade i lysosomala biogenesis förekommer i de flesta åldrande celler. Kortfattat är exogen X-gal, som tillämpas på celler, spjälkas av β-galaktosidas anrikas i lysosomer åldrande celler, vilket ger upphov till en blå färg 9. De blå åldrande celler kan därefter kvantifieras under en ljus fält mikroskop. Även om mycket populär presenterar β-galaktosidasanalysen stora nackdelar. Det första är denna analys utförs på fixerade celler. Det andra, det är tidskrävande eftersom det innebär att kvantifiera graden av åldrande genom att räkna ett signifikant högt antal åldrande celler i mikroskop. Tredje, denna analysär inte känslig som diskriminering mellan åldrande och icke-åldrande celler helt förlitar sig på betraktaren.
Vi diskuterar här en outnyttjad, snabb och känslig flödescytometri-baserad analys för att bedöma om de innehåller levande åldrande celler. Denna analys är baserad på hydrolys av ett membran permeabelt molekyl, den 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C 12 FDG), genom β-galaktosidas anrikas i åldrande celler. Efter hydrolys och laserexcitation avger C 12 FDG grön fluorescens och kan därför detekteras genom flödescytometri 10, 11. Detekteringen av åldrande celler via flödescytometri erbjuder den stora fördelen av att vara snabb och känslig. Dessutom kan detektering av åldrande celler genom flödescytometri kopplas med upptäckten av andra cellulära markörer. Denna analys kan användas för att detektera åldrande celler i en population av cancerceller behandlade med kemoterapi och kan rutinmässigt ställaupp på vävnadssnitt, efter cellulär dissociation, i klinik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenteras här en flödescytometri-baserad metod för att kvantifiera cellulärt åldrande med levande cancerceller. Denna metod är baserad på användningen av membranet permeabel förening, C 12 FDG, och kan därför användas i alla celltyper och efter olika behandlingar så länge som föreningen tas upp av cellerna. Vid cellulärt upptag är C 12 FDG hydrolyseras av β-galaktosidas, anrikas i lysosomer åldrande celler. Efter laser excitation avger föreningen gröna fluorescensen, vilke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar SF 4206 iCore (Université de Caen) för användningen av cytometry anläggningen. JC fick postdoktorala stipendier från Conseil de strålskydd d'EDF och Conseil Régional av Basse-Normandie. Dessa uppgifter var en del av projekt som finansieras av Ligue Nationale contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
