מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט
Summary
קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.
Abstract
קינאזות אוצין החוזרת עשיר 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs אשר חולק ארגון תחום דומה, לרבות תחום קינאז סרין-תראונין, ראס של תחום חלבונים מורכב (ROC), C-מסוף של תחום ROC (COR), ולאוצין עשיר וחוזר כמו ankyrin-בN-הסופית. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד LRRK2 הוא מעורב בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול לתייג חלבוני LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות זירחון הכוללות של 2 החלבונים האלה בתאים. בקיצור, זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמהשעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנות ובכך רדיואקטיבית. באמצעות תג הזיקה (3xflag) חלבוני LRRK מבודדים ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי לפקח זירחון של כל חלבון אחר שיכול לבוא לידי ביטוי בתאים ומבודד על ידי immunoprecipitation.
Introduction
קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs multidomain אשר חולק ארגון תחום דומה. שני החלבונים לקודד רצף GTPase דומה למשפחת ראס של GTPases (ראס של חלבונים מורכבים, או ROC), כמו גם בטרמינל C-של תחום ROC (COR), ביעילות סיווג שני החלבונים למשפחת חלבוני Roco 5,6. N-מסוף של טנדם תחום ROC-COR, שני החלבונים לקודד תחום חוזר לאוצין עשיר, כמו גם תחום כמו ankyrin-, בעוד שרק LRRK2 מקודד ארמדיל נוסף domein 6-8. בטרמינל C-של ROC-COR, שני החלבונים לשתף תחום קינאז סרין-תראונין בעוד שרק LRRK2 מקודד תחום WD40 באזור טרמינל C-8. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד נקודות ראיות גנטיות לתפקיד לLRRK2 בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4.
<p class = "jove_content"> זירחון של חלבונים הוא מנגנון רגולציה משותף בתאים. לדוגמא, זרחון יכול להיות חיוני להפעלה של אנזימים או לגיוס של חלבונים מורכבים איתות. זירחון הסלולרי של LRRK2 התאפיין בהרחבה ומיפוי phosphosite הראה רוב אתרי זירחון הסלולרי להתרחש באשכול בין חוזר ankyrin ותחומים חוזרים עשירים לאוצין 9-11. למרות שאתרי זירחון הסלולרי LRRK1 עדיין לא ממופים, ראיות ממחקרים באמצעות מכתים phosphoprotein של כתמי חלבון LRRK1 immunoprecipitated של מתאי COS7 מצביעות על כך שחלבון LRRK1 פוספורילציה בתאים 12.מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת הגנה של מחזור LRRKתוספות באות לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גם למייקל ג'יי פוקס קרן תמיכה במחקר זה. אנו מודים לקרן המחקר – פלנדריה FWO (פרויקט FWO G.0666.09, מלגת חוקר בכירה לJMT), Neuro-TARGET פרויקט IWT SBO/80020, לובן KU (OT/08/052A וIOF-KP/07 / 001) על תמיכתם. מחקר זה נתמך גם בחלקו על ידי קרן Druwé-Eerdekens מנוהל על ידי קרן המלך בודואן לJMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
Referências
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson’s disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson’s disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).
