Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain proteiner som koder både GTPase-og kinase-domener og som er fosforylert i celler. Her presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle sine samlede mobil phophorylation nivåer.
Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er paralogs som deler et lignende domene organisasjon, inkludert en serin-treonin-kinase-domene, et Ras av komplekse proteiner domene (ROC), et C-terminalt domene av ROC (COR), og leucin-rik og Ankyrin-lignende gjentagelser ved N-terminus. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens LRRK2 er implisert i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4. I denne rapporten presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 proteiner i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle den samlede fosforylering nivåer av disse to proteiner i celler. I korte trekk, affinitet tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-orthophosphate er assimilert av cellene etter bare et fåtalltimers inkubering og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Via den affinitet tag (3xflag) de LRRK proteiner er isolert fra andre cellulære komponenter av immunoprecipitation. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots. Protokollen kan lett tilpasses for å overvåke fosforylering av ethvert annet protein som kan uttrykkes i celler, og isoleres ved immunoutfelling.
Leucine rikt gjenta kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain paralogs som deler en lignende domene organisasjon. Begge proteiner koder en GTPase-sekvens beslektet med Ras familien GTPases (RAS av komplekse proteiner, eller ROC) så vel som et C-terminalt domene av ROC (COR), en effektiv måte å klassifisere begge proteiner til ROCO protein familien 5,6. N-terminalen av ROC-COR domene tandem, begge proteiner koder en leucin-rik vendende domene, samt en Ankyrin-lignende domene, mens bare LRRK2 koder for et ekstra armadillo domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, både proteiner dele en serin-treonin kinase domenet mens bare LRRK2 koder for et WD40 domene i C-terminal region 8. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens genetisk bevis peker mot en rolle for LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4.
<pclass = "jove_content"> Fosforyleringen av proteiner er en vanlig reguleringsmekanisme i celler. For eksempel kan fosforylering være essensielle for aktiveringen av enzymer eller ved rekruttering av proteiner til et signalkompleks. Den cellulære fosforylering av LRRK2 har blitt grundig beskrevet og phosphosite kartlegging har vist et flertall av mobilnettet fosforylering sider for å oppstå i en klynge mellom Ankyrin gjenta og leucine rike gjenta domener 9-11. Selv LRRK1 cellular fosforylering nettsteder har ennå ikke kartlagt, bevis fra studier med fosfoprotein farging av blotter av immunoutfelt LRRK1 protein fra COS7 celler tyder på at LRRK1 protein er fosforylert i celler 12.Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteins er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Affiniteten tag (3xflag) blir så brukt til å isolere de LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunoutfelling. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots.
Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som er eksponert for medium inneholdende 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktiv…
The authors have nothing to disclose.
Vi er også takknemlig til Michael J. Fox Foundation støtter denne studien. Vi takker Research Foundation – Flandern FWO (FWO prosjektet G.0666.09, senior forsker fellesskapet til JMT), den IWT SBO/80020 prosjektet Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A og IOF-KP/07 / 001) for deres støtte. Denne forskningen ble også støttet delvis av fondet Druwé-EERDEKENS forvaltes av Kong Baudouin Foundation til JMT.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |