שינוי רב היקף של שתלים מתכתיים עם מילויים נקבוביים, Polyelectrolytes וניטורם העקיף<em> בvivo</em
Summary
בסרטון הזה, נדגים טכניקות שינוי לשתלים מתכתיים נקבוביים כדי לשפר את הפונקציונליות שלהם ולשלוט בנדידת תאים. טכניקות כוללות פיתוח הדרגתיים נקבובית כדי לשלוט בתנועת תא ב3D וייצור של קרום במרתף מחקה כדי לשלוט בתנועת תא ב2-D. כמו כן, שיטה המבוססת על HPLC בשילוב שתל ניטור ב-vivo באמצעות ניתוח של חלבונים בדם מתוארת.
Abstract
שתלים מתכתיים, בעיקר שתלים טיטניום, נמצאים בשימוש נרחב ביישומים קליניים. רקמה בצמיחה ובאינטגרציה לשתלים אלו ברקמות הן פרמטרים חשובים לתוצאות קליניות מוצלחות. על מנת לשפר את שילוב רקמות, שתלים מתכתיים נקבוביים לי מפותחים. פתיחה הנקבוביות של קצף מתכתי הוא יתרון מאוד, שכן יכולים להיות פונקציונליות האזורים הנקבוביות מבלי להתפשר על התכונות מכאניות של המבנה כולו. כאן אנו מתארים שינויים כאלה בשימוש בשתלי טיטניום נקבוביים המבוססים על microbeads טיטניום. על ידי שימוש בתכונות הטבועות פיסיות כגון hydrophobicity של טיטניום, ניתן להשיג הדרגתיים נקבובית הידרופובי בתוך שתלים מתכתיים מבוסס microbead ובו בזמן יש קרום במרתף דומים המבוסס על פולימרים הידרופילי, טבעיים. הדרגתיים נקבובית 3D נוצרים על ידי פולימרים סינטטיים כגון חומצת פולי-L-לקטית (PLLA) על ידי שיטת הקפאת חילוץ. 2D nanofibrillar סורפרצופים נוצרים על ידי השימוש בקולגן / אלגינט ואחריו צעד crosslinking עם crosslinker טבעי (genipin). סרט nanofibrillar זה נבנה על ידי שכבה אחרת שכבה (LbL) שיטת תצהיר של שתי המולקולות הטעונות הפוך, קולגן ואלגינט. לבסוף, ניתן לקבל בו שתל אזורים שונים יכולים להכיל תאים מסוגים שונים, כפי שהדבר דרושים לרקמות תאיות רבות. על ידי, ניתן לשלוט בתנועת הסלולר בדרך זו בכיוונים שונים על ידי תאים מסוגים שונים. מערכת כזו מתוארת למקרה הספציפי של קנה הנשימה התחדשות, אבל זה יכול להיות שונה לאברי המטרה אחרים. ניתוח של נדידת תאים והשיטות האפשריות ליצירת שיפועים נקבוביות שונים פירט. השלב הבא בניתוח של שתלים כאלה הוא אפיונם לאחר השתלה. עם זאת, ניתוח היסטולוגית של שתלים מתכתיים הוא תהליך ארוך ומסורבל, ובכך לתגובת מארח ניטור לשתלים מתכתיים in vivoהשיטה מבוססת על ניטור lternative חלבוני דם CGA ושונים היא גם תאר. שיטות אלה יכולים לשמש לפיתוח בהגירת מחוייט מבחנה ובדיקות קולוניזציה ולשמש גם לניתוח של שתלי מתכת פונקציונליות in vivo ללא היסטולוגיה.
Introduction
נכון לעכשיו זמינים שתלים מתכתיים מתאימים ליישומי עומס נושאות, אבל שאינו מחייבים פריקותיהם עיצובים אשר להבטיח ממשק חזק עם הרקמה הסובבת אותם 1. על ידי מתן מבנים המאפשרים הסלולר בצמיחה והתישבות in vivo, חיים שלמים של שתלים מתכתיים יכולים להיות ממושך 2. שתלים מתכתיים בגלוי נקבובי מבטיחים חומרים להנדסת רקמות ממשק וגם להבטחת קולוניזציה טובה של השתלים. הם כבר השתמשו באופן פעיל כשתלים אורתופדיים וגם כשתלים קנו נשימת 3-5. עם זאת, עדיין יש בעיות שצריכות לפתור, כגון שליטה המדויקת תנועת תא באזורים הנקבוביות. אי שליטה בתהליך זה עלול להוביל להתישבות שלמה בקצה אחד וrestenosis בצד השני. גם functionalization נוסף של שתלים אלו הוא הכרחי להשגת פונקציות גבוהות יותר, כגון, מסירה של גורמי גדילה,כלי דם בבימויו ובתנועה בו זמנית של תאים מסוגים שונים 6-8. לשתלים בקנה נשימה, זה חיוני כמו קולוניזציה של השתל על ידי רקמת vascularized רצויה. עם זאת, בלתי מבוקרת של הרקמות בצמיחה ללומן של קנה הנשימה אינן רצויות משום שהיא מקטינה patency שתל.
אפשרות אחת כדי לשלוט בתנועת תא היא הדרת גודל. אם תדע את הגודל של תאי המטרה וביכולתם לקיים אינטראקציה עם פולימר סינטטי נתון זה אפשרי לפתח הדרגתיים של נקבוביות אשר יכול למעשה לקבוע את העומק של תנועת תא. למשל על ידי יצירת ארכיטקטורה נקבובית כי הוא גדול מספיק לכניסה של תאי רקמות חיבור, כגון fibroblasts extraluminally, אך קטן מספיק (פחות מ -10 מיקרומטר) כדי למנוע התנועה שלהם intraluminally שליטה אפקטיבית על קולוניזציה של שתל צינורי יכול להיות מושגת.
משיטות ליצירה נקבוביות זמינות, כגון הקפאת dryiנג, שטיפת חלקיקים, גז קצף 9,10; הקל ביותר כדי להתאים שיטה להיווצרות מהירה של מעברי צבע נקבוביות עם כמות מינימאלית של ציוד הדרוש הוא להקפיא מיצוי 11. בשיטה זו, פתרון פולימר הוא קפוא בתערובת בינארית של ממס אורגני ומים. לאחר מכן, החליף הממס באמצעות מיצוי בנוזל ליל מראש צונן כגון אתנול. הקפאה ותנאי חילוץ לקבוע את הצורה ואת הגודל של הנקבוביות ואם החילוץ נעשה באופן שבו ניתן לשלוט בתנועה של פתרון החילוץ, גודל וצורה נקבובית יכולים להיות directionally מווסת.
צעד שני לרקמות תאיות הוא היווצרות מחסומים נקבוביים בין סוגי תאים שונים לשליטה באינטראקציה ביניהם. זה גם הכרחי לזמינות של microenvironments שונה לסוגי תאים שונים, בהתאם לדרישות שלהם 12,13. קנה נשימה היא איבר צינורי שמחבר את הגרון עם bronchאני. יש לו בטנה פנימית pseudostratified אפיתל הריסים עם תאי גביע אשר מייצרים ריר interdispersed. מבנה 3D והיציבות של קנה הנשימה הוא מתוחזק על ידי סחוס בצורה של C-טבעות. כך, בקנה נשימה מלאכותית לא אמורה להיות צומת מוגדרת בין רקמת החיבור ושכבת אפיתל הריסים. בעוד מבנה 3D הוא הכרחי עבור חלק רקמת החיבור, ההגירה של תאי האפיתל מחייבת קרום דמוית מרתף פני השטח כדי להשיג תנועה כיוונית וסגירת הפצע. סרטים רבים שכבתיים polyelectrolyte (PEMs) הם אופציה אפשרית אחת להשיג מחקה קרום במרתף. שיטת שכבה אחר שכבה (LbL) היא תהליך תכליתי להשיג ציפוי פני שטח דק ופונקציונלי. היא מבוססת על אינטראקציות אלקטרוסטטיות של שתי polyelectrolytes הטעונים הפוך והצטברותם באופן רציף כדי לקבל קנה המידה ננומטרי ציפוי פני שטח שתכונותיו יכול להיות מגוונות על ידי משתנים פשוט משתנים כגון מיני polyelectrolyte, pH,מספר שכבה, תוספת של שכבת מכסת, אחד וכו 'crosslinking היתרונות העיקריים של שיטת LbL היא היכולת שלה להתאים את הטופוגרפיה של המצע הבסיסי. לכן, בתנאים מבוקרים בשיטה זו יכולה לשמש גם לקבלת משטח כיסוי של מבנים נקבוביים. אם הקולגן משמש כאחד מpolyelectrolytes זה אפשרי להשיג מבני nanofibrillar שיכול לחקות את פני השטח של קרום במרתף. Hydrophobicity של טיטניום מאפשר פיתוח של מבנים כאלה וfibrillarity ניתן לשמר בציפוי עבה 14. יכולים גם להיות נשלטו קובץ מצורף והתנועה של תאים על פני השטח בדרך זו. באמצעות הקפאת חילוץ וציפוי סרט LbL ברצף, ניתן להשיג מבנה שבו תנועת תא יכולה להיות נשלט רוחבי, אורכי circumferentially 15.
כאן אנו מתארים שתי שיטות חדשניות לשינוי שתלי טיטניום באמצעות ההתנהגות הידרופובי שלהם שיכולים להיותהוארך לשינוי של שתלים נקבוביים שונים: א) היווצרות הדרגתיים של micropores בתוך שתלי טיטניום macroporous עם הידרופובי, פולימרים סינטטיים ii) היווצרות של שכבת סרט פולימרים עבה על פני השטח השתל שתומך בגדילת תאים והיווצרות רירית ידי multilayers polyelectrolyte. ניתן להשתמש בשיטות אלה ברצף או בנפרד. הם מספקים מבנים המבטיחים הגירה מבוקרת וארגון המרחבי של תאים מסוגים שונים ברקמות תאיות 16,17. למקרה הספציפי של קנה הנשימה, את התוצאה הרצויה לשתל תהיה קולוניזציה על ידי רקמת fibrovascular בתוך הדרגתיים micropore ללא restenosis וההיווצרות של הציפוי הפנימי של תאי אפיתל ריסים על multilayers polyelectrolyte.
אחת דרכים לשליטה באינטגרציה של שתלים היא לעשות התערבויות כירורגיות קטנות בתקופת האינטגרציה שלהם עם המארח באתרו. על מנת להיות לא מסוגלo להחליט על העיתוי של ההתערבויות, חשוב לקבל מידע על ההשפעות המערכתיות של השתל. חלבון מגיב C (CRP) כבר משמש לניטור של זיהום ותגובה דלקתית במסגרות קליניות. Chromogranin (CGA) יכול לשמש גם באופן דומה ועשויים לספק תוצאות מדויקות יותר כדי לבחון את הרמה של דלקת 18. כדרך אפשרית של התבוננות אינטגרציה שתל מתכתית in vivo, אנו מציגים הליך ניטור רציף של תופעות מערכתיות שתל על ידי אפיון של דגימות דם של בעלי חיים עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ורצף חלבון שלאחר מכן. שכלול של שיטה זו יכול לשמש גם כדי להתחמק מניתוח היסטולוגית נקודת סיום קבוע. חיתוך היסטולוגית של שתלים מתכתיים הוא תהליך ארוך, מסורבל ויקר, ויכול להתבצע רק בנקודות זמן ספציפיות. בגלל סיבה זו, בדיקות דם המספקים מידע חזק על בריאות השתל מתוכננת היטב, הייתייהיו מסלולים אפשריים כדי להקטין את הניסויים בבעלי חיים כפי שנקבע לפי כללי האיחוד האירופי האחרונים הנוגעים לניסויים בבעלי החיים.
השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש כדי לשפר את הביצועים של שתלים מתכתיים באמצעות functionalization או שיש דרך חלופית של ניטור את השתלים הקיימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדרגתיים נקבובית הם כלים חשובים בהנדסת רקמות ממשק והוא יכול לשמש את המערכת המתוארת כאן לבד או בשילוב עם שתלים מתכתיים כדי ליצור שיפוע נקבובית ללמוד נדידת תאים. המערכת אינה מחייבת כל הגדרה נוספת או ציוד נוסף מלבד מנדף כימי כדי לטפל בממסים אורגניים, ולכן זה יכול להיות ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים מבקשים להודות לד"ר אנדרה ודר וניקולא פרין לשתלי טיטניום ייצור, ק Benmlih להצטברות של תבניות הטפלון וד"ר ג? ךבוסט על עזרתו עם ניסויים בבעלי החיים. כמו כן, אנו מכירים באזור אלזס וPMNA (קוטב MATERIAUX et d'Nanosciences אלזס) לתרומה כספית.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Referências
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O’Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid – liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization – Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid – liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -. M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
