Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток
Summary
Мы разработали автоматизированную культуре клеток и допроса платформы для микро-масштабе экспериментов стимуляции клеток. Платформа предлагает простые, универсальный и точный контроль в выращивании и стимулирования небольших популяциях клеток и восстановление лизаты для молекулярного анализа. Платформа хорошо подходит для исследования, которые используют драгоценные клетки и / или реагентов.
Abstract
Изучение клеток в культуре (в пробирке анализа) предоставил важное понимание сложных биологических систем. Обычные методы и оборудование для анализа в пробирке хорошо подходят для изучения большого количества клеток (≥ 10 5) в миллилитре масштабе объемы (≥ 0,1 мл). Однако существует много случаев, когда это необходимо или желательно уменьшать размер культура сократить потребление интересующих клеток и / или реагенты, необходимые для их культуры, стимуляции или обработки. К сожалению, традиционные подходы не поддерживают точные и воспроизводимые манипуляции микро-масштабе культур и микрофлюидики основе автоматизированных систем в настоящее время являются слишком сложными и специализированными для рутинного использования в большинстве лабораторий. Чтобы решить эту проблему, мы разработали простой и универсальной технологической платформы для автоматизированного культуры, стимулирование и восстановление малых популяциях клеток (100 – 2000 клеток) в микро-масштабе объемс (1 – 20 мкл). Платформа состоит из набора фибронектина покрытием микрокапиллярах ("ячейки перфузии камеры"), в пределах которой микро-масштабе культур установлено, сохраняется, и стимулировали; цифровой микрофлюидики (ДМФ) устройство оснащено "передача" микрокапиллярах ("центрального узла »), который маршрутов клеток и реагентов к и от перфузии камеры; высокоточных шприцевой насос, который приводит транспортировки материалов между перфузии камеры и центральным узлом, и электронный интерфейс, который обеспечивает контроль над транспортировки материалов, которые скоординированы и автоматизированы с помощью заранее определенных сценариев. В качестве примера мы использовали платформу для облегчения изучения транскрипционной реакции, индуцируемые в иммунных клетках на заражение бактериями. Использование платформы позволило нам сократить потребление клетками и реагенты, свести к минимуму эксперимент до эксперимента изменчивость, и перенаправляют практический труд. Учитывая преимущества, что оно придает, а также его доступности и универсальности, оур платформа должна найти применение в самых различных лабораторий и приложений, а также оказаться особенно полезны в облегчении анализа клеток и стимулов, которые доступны только в ограниченных количествах.
Introduction
Изучение клетки поддерживали в культуре (в пробирке анализа) предоставил бесценный понимании фундаментальных принципов и молекулярных механизмов, регулирующих сложные биологические системы и здоровье человека. Обычных методов культуры, стимулирование, и сбор клеток для анализа, которые используют чашки Петри и планшеты для микротитрования, были разработаны для изучения больших популяций клеток (≥ 10 5) в миллилитре масштабе объемов культуры (≥ 0,1 мл). Тем не менее, есть много случаев, в которых только ограниченное количество клеток доступны (например, первичные клетки) или небольшой популяции клеток желательно (например, для уменьшения клетка-клетка изменчивость среди населения) или необходимых реагентов трудно получить или слишком дорого (например, очищенные клетки секретируемых факторов). Такие вопросы могут быть успешно решены путем масштабирования вниз культуре размера, который имеет дополнительное преимущество снижения потребления всехреагенты для анализа в 1,2 пробирке. К сожалению, обычные оборудование и методы, не поддерживают точные и воспроизводимые манипуляции микро-масштабе культур и микрофлюидики основе автоматизированных систем в настоящее время 3-11, слишком сложны и специализированные для рутинного использования в большинстве лабораторий.
В этом докладе мы описываем сборку и использование простой и универсальной технологической платформы для автоматизированного культуры, стимулирование и восстановление малых популяциях клеток (100 – 2000 клеток) в микро-масштабе объемы (1 – 20 мкл). Архитектура платформы (рис. 1) имеет модульную структуру: набор фибронектина покрытием микрокапиллярам ("ячейки перфузии камеры" модуль) служит в качестве площадки для установления, поддержания и стимулирования микро-масштабе культур и цифровые микрофлюидики (DMF ) 12,13 Устройство оснащено "передача" микрокапиллярам ("центральный узел" модуль) 14,15 маршрутах клеткии реагенты, и из перфузии камеры. DMF позволяет пользователю индивидуально адресации нескольких капель и одновременно изменить или изменить порядок манипуляций (т.е. перенастроить поездов обработки образцов) без изменения аппаратного устройства. Его огромную гибкость проявляется в его недавнее появление как ключевая технология в широком диапазоне применений, включая клеточную культуру 16,17, 18,19 ферментные тесты, иммунологические 20,21, 22,23 анализа ДНК, белков переработки, 24,25 и клинической обработки образца. 26,27 Наш центральный узел использует гибкость присущие ДМФА устройств, а также дополнительно усиливает его посредством добавления микрокапиллярных интерфейса, который предоставляет возможность осуществлять подмножество манипуляции (например, клеточная культура) в специализированных периферийных модулей, а не на устройстве ДМФА себя. Компартментализацией обработки поездов на этом пути также упрощает конструкцию плаTForm архитектуры (не нужно строить DMF устройство, которое может выполнять все этапы обработки) и облегчает его эволюцию как новые функции требуется (просто интегрировать новые периферийные модули по мере необходимости). Транспорт клеток и реагентов в пределах центрального узла обусловлен электросмачивания сил, возникающих при последовательной активации электродов в устройстве DMF 13,28; транспорта в, из и в пределах перфузии камеры питается от изменения давления порожденных высокоточных шприца насосе. Все эти жидкости движения управляется с помощью простой электронный интерфейс и автоматизирован посредством использования заранее определенных сценариев.
В качестве иллюстративного примера, мы демонстрируют использование платформы для изучения транскрипционной реакции, индуцируемые в иммунных клетках на заражение бактериями (рис. 2). Проведение этих экспериментов на платформе позволило нам работать с небольшим количеством клеток (~ 1000 в экспериментальныхТаль условие), свести к минимуму эксперимента до эксперимента изменчивости, экономии реагентов и перенаправить практический труд. Учитывая преимущества, что оно придает, а также его доступности и универсальности, эта платформа должна найти применение в самых различных лабораторий и приложений и быть особенно полезно в облегчении анализа клеток и стимулов, которые доступны только в ограниченных количествах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали простой и универсальной автоматизированной платформы для микро-масштабе культуре клеток и стимуляции экспериментов. Платформа позволяет нам работать с небольшими объемами культуры и клеточных популяций (1 – 20 мкл и 100 – 2000 клеток, в камере); культуры размеров может б?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Рональд Ф. Рензи и Майкл С. Барч за их вклад в проектирование и разработку устройств DMF и ступицей DMF. Это исследование было полностью поддерживается лаборатории, которой руководил научно-исследовательской программы в Sandia National Laboratories. Sandia является многопрофильным программы лаборатории управляется и эксплуатируется Sandia Corporation, дочерняя компания корпорации Lockheed Martin, для американского Министерства Национальной энергетической администрации по ядерной безопасности в рамках контракта DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
Referências
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry – Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
