Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu
Summary
Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.
Abstract
Kültür hücreleri (in vitro analizi) çalışması karmaşık biyolojik sistemlerin içine önemli fikir sağlamıştır. In vitro analizi için geleneksel yöntemler ve sistemler de mililitre ölçekli birimleri (≥ 0.1 ml) hücreleri (≥ 10 5), çok sayıda çalışma için uygundur. Ancak, bu ilgi ve / veya kültür, uyarılma ya da işlem için gerekli reaktiflerin hücre tüketimini azaltmak için kültür boyutunu aşağı ölçekte gerekli ya da arzu edilir olduğu birçok örneği vardır. Ne yazık ki, geleneksel yaklaşımlar mikro ölçekli kültürlerin hassas ve tekrarlanabilir manipülasyon desteklemez ve mevcut Mikroakiskan tabanlı otomatik sistemler çok karmaşık ve en laboratuvarlar tarafından rutin kullanım için uzmanlaşmıştır. Mikro ölçekli hacminde – Bu sorunu çözmek için, otomatik kültür, stimülasyon ve hücrelerin küçük nüfus (2.000 hücre 100) geri kazanımı için basit ve çok yönlü teknoloji platformu geliştirdiks (1-20 ul). Platform mikro ölçekli kültür, kurulan muhafaza ve uyarılır, içinde fibronektin kaplı mikrokapilerler ("hücre perfüzyon odaları"), bir dizi oluşur "transfer" mikrokapilerler ("merkez ile donatılmış bir dijital Mikroakiskan (DMF) cihazı "), ve perfüzyon odalarından yolları hücreleri ve reaktif olan, güçler perfüzyon odaları ve merkez arasında malzeme nakliyesi bir yüksek hassasiyetli şırınga pompası, hangi ve malzeme nakliyesi üzerinde kontrol sağlayan bir elektronik arayüz, hangi koordine ve önceden belirlenmiş komut ile otomatik. Bir örnek olarak, bakteri ile meydan bağlı bağışıklık hücrelerinde ortaya çıkardı transkripsiyonel yanıtlar çalışmayı kolaylaştırmak için platform kullanılır. Platformun kullanın bize, hücre ve reaktif tüketimini azaltmak deneme-için-deney değişkenliği en aza indirmek için etkin ve yeniden doğrudan eller emek. Bu bahşeder avantajları, hem de onun erişilebilirlik ve çok yönlülük, o göz önüne alındığındaur platformu laboratuar ve geniş bir uygulama çeşitli kullanım alanı bulur ve sadece sınırlı miktarlarda mevcut olan hücrelerin ve uyaranların çözümlenmesini kolaylaştıran çok özellikle faydalı olabilir gerekir.
Introduction
(In vitro analizinde) kültür muhafaza hücrelerin çalışma karmaşık biyolojik sistemlerin ve insan sağlığı düzenleyen temel ilke ve moleküler mekanizmaları içine değerli fikir sağlamıştır. Kültür, uyarılma ve Petri kutularına ve mikro-titer plakalar kullanmak analizi için hücreler, toplanması için konvansiyonel yöntemler mililitre çapta kültür hacmi hücreleri (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml) arasında geniş popülasyonların çalışması için tasarlanmıştır. Ancak, hücrelerin sadece sınırlı bir miktarda mevcut olduğu bir çok durumda (örneğin, birincil hücreler), ya da küçük hücre popülasyonları (örneğin nüfus içerisindeki hücre-hücre değişkenliği azaltmak için) arzu edilir veya gerekli reaktiflerin elde etmek zordur veya pahalı (örneğin saflaştırılmış hücre-salgılanan faktörler). Bu tür sorunlar başarıyla kültür boyutunu küçültme tarafından ele alınabilir, hangi tüm tüketimi azaltmak yararı vardırReaktifler in vitro analiz 1,2 için gerekli. Ne yazık ki, geleneksel ekipman ve yöntemleri mikro ölçekli kültür ve 3-11 çok karmaşık ve en laboratuvarlar tarafından rutin kullanım için özel olan mevcut Mikroakiskan tabanlı otomatik sistemlerin hassas ve tekrarlanabilir manipülasyon desteklemez.
Mikro ölçekli hacimlerde (1 – 20 ul) – Bu yazıda, otomatik kültür, stimülasyon ve hücrelerin küçük nüfus (2.000 hücre 100) geri kazanımı için basit ve çok yönlü teknoloji platformu montajı ve kullanımı açıklanmaktadır. Fibronektin kaplı mikrokapilerler ("hücre perfüzyon odaları" modülü) mikro ölçekli kültürlerin kurulması, bakım ve uyarılması için site olarak hizmet veren bir dizi ve bir dijital Mikroakiskan (DMF: platform mimarisi (Şekil 1) modüler yapıda olup "transfer" mikrokapilerler ("merkez" modülü) 14,15 yolları hücreleri ile donatılmış) 12,13 cihazve ve perfüzyon odaları reaktifleri. DMF kullanıcı ayrı ayrı aynı anda birden fazla damlacıkları ele ve cihaz donanım değiştirmeden manipülasyonlar (yani yeniden örnek işleme tren) değiştirmek veya yeniden sipariş edebilirsiniz. Onun büyük esneklik hücre kültürü 16,17, enzim testleri 18,19, immün 20,21, DNA analizi 22,23, protein işleme, 24,25 de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi, önemli bir teknoloji olarak son ortaya çıkması belirgindir ve klinik örnek işleme. 26,27 Bizim merkez DMF cihazlara doğal esneklik yararlanır, ve daha fazla uzman periferik manipülasyonlar bir alt kümesi (örneğin hücre kültürü) gerçekleştirmek için bir fırsat sunuyor microcapillary arayüzleri, ilavesi aracılığıyla artırır DMF yerine aygıtın kendisinde daha modülleri. Bu şekilde işleme tren bölümlere de pla tasarımı kolaylaştırırtform mimari (tüm işlem adımları taşıyabilen bir DMF cihaz oluşturmak için gerek yok) ve yeni fonksiyonlar olarak evrimi kolaylaştırır (sadece gerekli gibi yeni çevresel modüller entegre) gerekmektedir. Merkez içinde hücreleri ve reaktiflerin taşıma DMF cihaz 13,28 içinde elektrotlar sıralı aktivasyon tarafından oluşturulan kuvvetler electrowetting tarafından sürülür; gelen, ulaşım ve perfüzyon odaları içinde yüksek hassasiyetli şırınga tarafından oluşturulan basınç değişiklikleri tarafından desteklenmektedir pompa. Bu sıvı hareketlerin tüm basit bir elektronik arabirimi üzerinden kontrol ve önceden belirlenmiş komut kullanımı ile otomatik vardır.
Temsili bir örnek olarak, bakteri ile meydan okuma (Şekil 2) üzerine bağışıklık hücrelerinde ortaya çıkardı transkripsiyonel yanıtların çalışma için platformun kullanımını göstermektedir. Platformda bu deneyler bize hücrelerin az sayıda (deneysel başına ~ 1000 ile çalışmak için etkintal durumu), deneme-to-deney değişkenliği, tasarrufu reaktifler ve emek eller yeniden doğrudan en aza indirmek. Bu avantaj sağladığını, hem de onun erişilebilirlik ve çok yönlülüğü göz önüne alındığında, bu platform laboratuar ve geniş bir uygulama çeşitli kullanım alanı bulur ve sadece sınırlı miktarlarda mevcut olan hücrelerin ve uyaranların çözümlenmesini kolaylaştıran çok özellikle faydalı olabilir gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu mikro ölçekli hücre kültürü deneyleri ve uyarılması için basit ve çok yönlü bir otomatik bir platform geliştirdik. Kültür boyutları daha küçük çaplı mikrokapilerler kullanımı ile azaltılabilir; platformu bize küçük kültür hacimleri ve hücre popülasyonlarının (- – 20 ul ve 100 2.000 hücreleri, oda başına 1) ile çalışmasını sağlar. Bu ölçeklerde çalışan rutin çalışmaların maliyetini düşürür ve değerli reaktifler ve / veya hücrelerin kullanımı gerektire…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar DMF cihazları ve DMF merkezi tasarım ve geliştirme katkıları için Ronald F. Renzi ve Michael S. Bartsch teşekkür ederim. Bu araştırma tam Sandia Ulusal Laboratuarlarında Laboratuvarı Yönetmen Araştırma ve Geliştirme Programı tarafından desteklenmiştir. Sandia sözleşme DE-AC04-94AL85000 altında Enerji Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi ABD için Sandia A.Ş., Lockheed Martin Corporation'ın iştiraki, tarafından yönetilen ve işletilen bir çok programı laboratuvardır.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
Referências
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry – Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
