Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular
Summary
Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.
Abstract
Estudio de las células en cultivo (análisis in vitro) ha proporcionado datos importantes en los sistemas biológicos complejos. Métodos y equipos convencionales para el análisis in vitro son muy adecuadas para el estudio de un gran número de células (≥ 10 5) en volúmenes de escala ≥ mililitro (0,1 ml). Sin embargo, hay muchos casos en los que es necesario o deseable que reducir el tamaño cultura para reducir el consumo de las células de interés y / o reactivos necesarios para su cultura, estimulación, o de procesamiento. Desafortunadamente, los enfoques convencionales no soportan una manipulación precisa y reproducible de cultivos de micro-escala, y los sistemas automatizados de microfluidos basados actualmente disponibles son demasiado complejas y especializadas para el uso rutinario por la mayoría de los laboratorios. Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado una plataforma de tecnología simple y versátil para el cultivo automatizado, estimulación, y la recuperación de pequeñas poblaciones de células (100 – 2000 células) en el volumen de micro-escalas (1 – 20 l). La plataforma consta de un conjunto de microcapilares recubiertos de fibronectina ("cámaras de perfusión de células"), dentro de la cual se establecieron cultivos de micro-escala, mantienen, y se estimularon; un dispositivo digital de microfluidos (DMF) equipado con "transferencia" microcapilares ("cubo central "), el cual las células rutas y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión; una bomba de jeringa de alta precisión, que alimenta el transporte de materiales entre las cámaras de perfusión y el eje central, y una interfaz electrónica que proporciona control sobre el transporte de materiales, que es coordinado y automatizado a través de scripts predeterminados. Como un ejemplo, se utilizó la plataforma para facilitar el estudio de las respuestas transcripcionales provocados en las células inmunes al reto con bacterias. El uso de la plataforma nos ha permitido reducir el consumo de las células y los reactivos, minimizar la variabilidad experimento a experimento, y re-directos práctica laboral. Dadas las ventajas que ésta confiere, así como su accesibilidad y versatilidad, Oplataforma ur debe encontrar uso en una amplia variedad de laboratorios y aplicaciones, y ser especialmente útil para facilitar el análisis de las células y los estímulos que están disponibles sólo en cantidades limitadas.
Introduction
El estudio de las células se mantuvieron en cultivo (análisis in vitro) ha proporcionado valiosa información sobre los principios fundamentales y los mecanismos moleculares que regulan los complejos sistemas biológicos y la salud humana. Los métodos convencionales para el cultivo, la estimulación, y colección de las células para el análisis, que utilizan placas de Petri y las placas de microtitulación, se han diseñado para el estudio de grandes poblaciones de células (≥ 10 5) en volúmenes de cultivo escala ≥ mililitro (0,1 ml). Sin embargo, hay muchos casos en los que sólo cantidades limitadas de células están disponibles (por ejemplo, células primarias), o pequeñas poblaciones de células son deseables (por ejemplo, para reducir la variabilidad de célula a célula a través de la población), o reactivos requeridos son difíciles de obtener o prohibitivamente caro (por ejemplo, factores secretados por células purificadas). Estos temas pueden ser abordados con éxito por la escala hasta el tamaño cultura, que tiene el beneficio adicional de reducir el consumo de todos losreactivos necesarios para el análisis pt 1,2 vitro. Desafortunadamente, el equipo y los métodos convencionales no soportan la manipulación precisa y reproducible de las culturas micro-escala y los sistemas automatizados de microfluidos basadas actualmente disponibles 3-11 son demasiado complejos y especializados para el uso habitual en la mayoría de los laboratorios.
En este reporte se describe el montaje y el uso de una plataforma de tecnología simple y versátil para el cultivo automatizado, el estímulo y la recuperación de las pequeñas poblaciones de células (100 – 2000 células) en los volúmenes de micro-escala (1-20 l). La arquitectura de la plataforma (Figura 1) es de diseño modular: un conjunto de fibronectina recubierto microcapilares ("cámaras de perfusión de células" módulo) sirve como el sitio para el establecimiento, el mantenimiento, y la estimulación de cultivos de micro-escala, y un microfluídica digital (DMF ) 12,13 14,15 dispositivo equipado con células de rutas "transferencia" microcapilares (módulo central "hub")y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión. DMF permite al usuario resolver individualmente varias gotas al mismo tiempo y cambiar o volver a ordenar las manipulaciones (es decir, volver a configurar los trenes de procesamiento de la muestra) sin alterar el hardware del dispositivo. Su gran flexibilidad es evidente en su reciente aparición como una tecnología clave en una amplia gama de aplicaciones, incluido el cultivo celular 16,17, 18,19 ensayos enzimáticos, inmunoensayos 20,21, 22,23 análisis de ADN, el procesamiento de proteínas, 24,25 y procesamiento de la muestra clínica. 26,27 Nuestro cubo central toma ventaja de la flexibilidad inherente a los dispositivos de DMF, y se mejora aún más mediante la adición de interfaces de microcapilares, lo que proporciona la oportunidad de llevar a cabo un subconjunto de manipulaciones (por ejemplo, cultivo celular) en periférica especializada módulos, en lugar de en el dispositivo de DMF en sí. La compartimentación de los trenes de procesamiento de esta manera también simplifica el diseño de la plaArquitectura TForm (sin necesidad de construir un dispositivo de DMF que pueden llevar a cabo todas las etapas de elaboración) y facilita su evolución como nuevas funciones se requieren (simplemente integrar nuevos módulos periféricos, según sea necesario). Transporte de las células y los reactivos dentro del cubo central es accionado por electrohumectación fuerzas generadas por la activación secuencial de electrodos dentro del dispositivo de DMF 13,28; transporte hacia, desde y dentro de las cámaras de perfusión es impulsado por los cambios de presión generados por una jeringa de alta precisión bomba. Todos estos movimientos fluidos son controlados a través de una interfaz electrónica simple y automatizado a través del uso de secuencias de comandos predeterminados.
Como ejemplo representativo, se demuestra el uso de la plataforma para el estudio de las respuestas transcripcionales provocado en las células inmunes al reto con bacterias (Figura 2). La realización de estos experimentos en la plataforma nos permitió trabajar con un pequeño número de células ~ 1000 por la experimentación (condición de tal), minimizar la variabilidad experimento a experimento, reactivos conservar y volver a dirigir las manos-sobre el trabajo. Dadas las ventajas que ésta confiere, así como su accesibilidad y versatilidad, esta plataforma debe encontrar uso en una amplia variedad de laboratorios y aplicaciones y resultar especialmente útil para facilitar el análisis de las células y los estímulos que están disponibles sólo en cantidades limitadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado una plataforma automatizada simple y versátil para el cultivo celular micro-escala y experimentos de estimulación. La plataforma nos permite trabajar con pequeñas cantidades de cultivos y poblaciones de células (1 – 20 ly 100 – 2000 células por cámara); tamaños cultura podría reducirse aún más mediante el uso de microcapilares de menor diámetro. Trabajar en estas escalas reduce el costo de estudios de rutina y hace que los estudios viables que requieren el uso de reactivos precioso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Ronald F. Renzi y Michael S. Bartsch por sus contribuciones al diseño y desarrollo de dispositivos de DMF y el cubo DMF. Esta investigación fue plenamente apoyada por el Programa de Desarrollo de Laboratorio Director de Investigación y en Sandia National Laboratories. Sandia es un laboratorio multi-programa administrado y operado por Sandia Corporation, una subsidiaria de propiedad total de Lockheed Martin Corporation, para el Departamento de Administración de Seguridad Nuclear Nacional de Energía de los EE.UU. bajo contrato DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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