ينطوي على طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT تصور خلايا مستقبلة للضوء الفسيفساء في ذبابة الفاكهة الحية. ويمكن استخدامه لمتابعة مصائر فردية خلية مستقبلة للضوء في شبكية العين لعدة أيام أو أسابيع. هذه الطريقة مثالية للدراسات تنكس الشبكية وأمراض الاعصاب أو تطوير خلايا مستقبلة للضوء.
ويستخدم على نطاق واسع العين ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسات التنمية وتنكس الخلايا العصبية. مع تقنية قوية الإنقسامية إعادة التركيب، أدت شاشات الوراثية أنيقة على أساس تحليل نسيلي لتحديد مسارات الإشارات المشاركة في التنمية والعين مبصرة (PR) التمايز في مراحل اليرقات. نحن هنا وصف طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT، والتي يمكن استخدامها لتحليل نسيلي السريع في عين يعيشون الكبار ذبابة الفاكهة. يتم تصوير خلايا مستقبلة للضوء الفلورسنت مع تقنية تحييد القرنية، على شبكية العين مع استنساخ الفسيفساء التي تم إنشاؤها بواسطة بوساطة flipase إعادة التركيب. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة عدة على باجتزاء النسيجي الكلاسيكية من شبكية العين: ويمكن استخدامه لفحص عالية الإنتاجية وأثبت وسيلة فعالة لتحديد العوامل التي تنظم بقاء العلاقات العامة وظيفة. ويمكن استخدامه لتحليل الحركية للانحطاط العلاقات العامة في نفس أنيم المعيشةالقاعدة خلال عدة أسابيع، للتدليل على شرط جينات معينة لبقاء العلاقات العامة أو وظيفة في الطيران الكبار. هذه الطريقة مفيدة أيضا لمعالجة قضايا الحكم الذاتي خلية في المسوخ التنموية، مثل تلك التي يتأثر إنشاء خلية قطبية مستو.
وتتكون الشبكية من ذبابة الفاكهة حوالي 800 وحدة ommatidial (الشكل 1A)، والتي يتم تنظيمها على وجه التحديد، مع محور واضحة المعالم من القطبية (الشكل 1B). كل وحدة تحتوي على 20 الخلايا: ثمانية خلايا مستقبلة للضوء (PRS) و 12 خلايا الإكسسوارات، بما في ذلك الخلايا المخروطية، والخلايا الصبغية الشعر الخشن الخلايا 1،2. وتتميز فئتين من العلاقات العامة على أساس نوع رودوبسين (ره) التي تعبر عنها. المستفيدين الرئيسيين الستة الخارجي (R1-6) التعبير عن RH1 ومرتبة في نمط شبه منحرف (الشكل 1C). في وسط شبه منحرف، وهما المستفيدين الرئيسيين الداخلية (R7/R8) عن أربعة أنواع من الممكن رودوبسين (RH3، RH4، RH5 أو RH6) ويتم تنظيم مثل هذا R7 تقع على رأس R8 3.
ويشارك أكثر من 2،500 الجينات في التشكل من العين ذبابة الفاكهة 4، الذي أثبت نموذج قوية جدا للدراسات من لوحة واسعة من العمليات، بما في ذلك ديفي العينlopment والتوظيف والعلاقات العامة، والتمايز، والاستقطاب الخلية مستو، التشكل، البقاء على قيد الحياة، وموت الخلايا المبرمج تنبيغ البصرية 5-9.
الباحثون يعملون على العين ذبابة الفاكهة و، على مدى سنوات عديدة، وضعت تقنيات لتصوير الشبكية وتنفيذ شاشات جينية منتظمة. أسهل طريقة لصورة شبكية العين الكبار هو أن ننظر إلى القرنية في حيوان يجمد (الشكل 1A). هيكل القرنية يمكن تصور بدقة عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني، وكان يستخدم في شاشة الوراثية على نطاق واسع من قبل كونسورتيوم URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. هذا هو نهج فعال جدا لتصور التغيرات العالمية المورفولوجية في بنية القرنية، مثل خشونة العين أو معان، وغالبا ما يسببها طفرات في الجينات المسيطرة خطوات مبكرة في التنمية أو بقاء الخلية. ومع ذلك، والتصور العالمي للقرنية ليس سوfficient لتحديد العوامل التي تنظم العلاقات العامة PR rhabdomere التشكل أو الكبار الجدوى وظيفة. مثل هذه التحليلات تتطلب إجراء تحقيق شامل أكثر من النزاهة العلاقات العامة، على أساس المجهر المرحلة على النقيض من أقسام الراتنج شبه رقيقة عرضية من شبكية العين 11-13. هذا الأسلوب هو مناسبة لتحليلات الفسيفساء، والتي يمكن تحديدها من قبل المستفيدين الرئيسيين متحولة افتقارها للصباغ أحمر 14،15.
ويمكن أيضا استنساخ الفسيفساء متحولة يمكن تصور في تشريح كامل جبل من العذراء أو الكبار شبكية العين، على أساس افتقارها للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) إشارة على مضان المجهري 16،17. هذه التقنيات اثنين هي مفيدة جدا، ولكن كلاهما العمالة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي فهي ليست مناسبة لفحص واسعة النطاق. نحن وآخرون قد وضعت استخدام تقنيات القرنية تحييد للتصوير من المستفيدين الرئيسيين إنتاج البروتينات الفلورية 18،19، لتسهيل يحلل PR السريع. مع هذه التقنية، متحولةيمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة على أساس من تألق ذاتي من الأحمر (ث +) الصباغ في فسيفساء الكبار استنساخ ذبابة الفاكهة. ولكن، هل هذا الأسلوب لا يوفر القرار وحيدة الخلية المطلوبة لمعالجة قضايا الحكم الذاتي الخلية 19. تغلبنا على هذه المشكلة من خلال تطوير أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT، الذي يجمع بين التصوير من البروتينات الفلورية التي كتبها القرنية تحييد مع إعادة التركيب الإنقسامية 20. هذا الأسلوب يسمح للإنتاجية عالية، التعرف السريع والدقيق للالمستفيدين الرئيسيين متحولة في استنساخ الفسيفساء، في قرار وحيد الخلية ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). وهي مناسبة للاستخدام في التحليل الحركي، لمتابعة المستفيدين الرئيسيين الفردية على مدى فترة من أسابيع في ذبابة الفاكهة الحية. نحن هنا وصف طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT ونصائح لاستخدامها في، تحليلات بسيطة الحركية للعيون الفسيفساء.
وقد استخدم على نطاق واسع العين ذبابة الفاكهة فك مسارات إشارات تنظيم التنمية، وانتشار والبقاء على قيد الحياة. في 1990s في وقت مبكر، ونفذت عددا كبيرا من شاشات الوراثية إلى تحديد مسارات المطلوبة خلال المراحل الأولية لتطوير العلاقات العامة 25-27. تم زيادة كفاءة شاشات الوراثية إلى حد كبير بواسطة تقنية إعادة التركيب الإنقسامية، مما يجعل من الممكن لاختبار الخسارة من وظيفة الطفرات في استنساخ الفسيفساء 21. وبالتالي، يمكن اختبار دور الطفرات المميتة بشكل منهجي الجنينية في الحيوانات المستنسخة متحولة متماثلة اللواقح في أعين الذباب التي كانت متخالف خلاف ذلك. وقد ركزت معظم العروض الفسيفساء على توظيف العلاقات العامة في وقت مبكر، والتمايز، والإسقاط محور عصبي أو التشكل يحدث في اليرقات النامية أو الشرانق 10،25-31. حتى الآن، حققت الشاشة الفسيفساء واحد فقط آليات تنظيم وظيفة العلاقات العامة الكبار، من خلال رصد استجابة بصرية عبر electroretinogram تسجيلات 32. مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT وإمكانية إجراء تحليل بالطبع الوقت في الحيوانات الحية متحولة، قمنا بتصميم طريقة جديدة لتحديد العوامل التي تنظم بقاء PR الكبار وتعمل 20،24.
طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT ديها العديد من المزايا الرئيسية خلال باجتزاء النسيجي الكلاسيكية للعيون جزءا لا يتجزأ من الراتنج. أولا، هذا الأسلوب هو أسرع بكثير وأرخص وأسهل لأداء من الطريقة النسيجية، شريطة أن المجهر مضان مجهزة الهدف غمس المياه المناسبة متاحة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات). الثانية، وطريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع التحوير التعبير، مثل التعبير عن P (UAS، ث +)، والتي تحمل التحوير المصغرة الأبيض. وعلى النقيض من المقاطع النسيجية، والذي يستخدم للكشف عن + ث النسيلي، في النظام الطماطم / GFP-FLP / FRT، P (UAS، ث +) لا تتداخل مع د النسيليetection يعتمد على الطماطم بروتين فلوري. باستخدام P (UAS-fatp، ث +) الذباب المعدلة وراثيا، وكنا قادرين على تصور الانقاذ من المستفيدين الرئيسيين متحولة fatp (الشكل 7). الثالث، وهو شرك الرئيسية لجميع أنواع التحليل نسيلي، بما في ذلك على أساس الطماطم / GFP-FLP / FRT، هو غموض الوراثي من المستفيدين الرئيسيين المفقودة. في الواقع، قد يكون من غير الواضح ما إذا كانت العلاقات العامة غائبة بسبب عدم وجود وظيفة جين معين أو بسبب خلية تأثير غير المتمتعة بالحكم الذاتي، ولا سيما على الحدود من استنساخ متحولة. يحصل على طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT تغلب على هذه المشكلة عن انحطاط من قبل مما يجعل من الممكن لمتابعة من النوع البري ومتحولة المستفيدين الرئيسيين في نفس الحيوان على مدى فترات من عدة أسابيع. كنا قادرين على متابعة مصير المستفيدين الرئيسيين الفردية الحركية يحلل على مختلف fatp الذباب متحولة (الشكل 6). ويمكن التعرف على استنساخ نفسه في حيوان معين في أوقات مختلفة، وذلك بسبب الشكل الدقيق للاستنساخ المحيطة من النوع البري. كنا قادرين على إظهار لا لبس فيهالاي أن جميع المستفيدين الرئيسيين المفقودة كانت متحولة لfatp، مشيرا إلى أن دور المسوخ fatp في المستفيدين الرئيسيين هو خلية مستقلة. وبالتالي، من خلال رصد فقدان المستفيدين الرئيسيين في التحليل الحركي، فمن الممكن لتحديد النمط الجيني من المستفيدين الرئيسيين في نماذج من انحطاط أخلاقي الحدوث. أخيرا، أثبتت طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT قوية جدا لتحديد العوامل التي تنظم إنشاء PCP 20. إمكانية تسجيله عددا كبيرا من ommatidia فسيفساء النمط الظاهري لقطبية دون الحاجة إلى أقسام، يسهل تحديد السريع لمتطلبات العلاقات العامة لإنشاء PCP. ومع ذلك، فإن تحليل أكثر دقة للوحدة العلاقات العامة تتطلب باجتزاء التقليدية تليها المرحلة على النقيض أو microscopies الإلكترونية.
في الختام، يفتح طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT آفاقا جديدة لكفاءة الفحص فسيفساء لتحديد العوامل التي تنظم العمليات التنموية والعلاقات العامة وظائف العلاقات العامة الكبار، مثل فيمااستجابة السياقية وقدرتها على البقاء.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM وDroso-أدوات مرافق UMS3444 العلوم البيولوجية، ليون، فرنسا. وأيد البحوث BM من خلال المنح المقدمة من مؤسسة بحوث ميديكال لا تصب من CNRS (ATIP) وANR-12-BSV1-0019-01. وأيد PD بواسطة الشبكية فرنسا الجمعيات ومدرسة المعلمين العليا في ليون (فرنسا). وأيد CL من قبل لوس انجليس الدوري الفرنسي الوطني للسرطان مناهضة لو الجمعيات.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |