Cet article décrit trois préparations du système nerveux à l'aide de sangsues: enregistrement intracellulaire de neurones dans les ganglions ventrale, la culture de neurones de ganglions ventrale, et l'enregistrement d'un morceau de peau innervée de mapper les champs sensoriels.
La chute d'eau douce, Hirudo medicinalis, est un organisme modèle polyvalent qui a été utilisé pour traiter des questions scientifiques dans les domaines de la neurophysiologie, neuroéthologie, et la biologie du développement. Le but de ce rapport est de consolider les techniques expérimentales du système de chute en un seul article qui sera utile pour les physiologistes de l'expertise dans d'autres préparations du système nerveux, ou pour les étudiants en biologie avec peu ou pas d'expérience de l'électrophysiologie. Nous démontrons comment disséquer la chute d'enregistrement intracellulaire de circuits neuronaux identifiés dans le ganglion. Ensuite, on montre comment les cellules individuelles de fonction connue peuvent être retirés à partir du ganglion être cultivées dans une boîte de Pétri, et la façon d'enregistrer à partir de ces neurones en culture. Ensuite, nous montrons comment préparer un patch de peau innervée être utilisé pour mapper les champs sensoriels ou moteurs. Ces préparations de sangsues sont encore largement utilisés pour traiter les propriétés électriques de base de networ de neuronesks, le comportement, la synaptogenèse et le développement. Ils sont également un module de formation approprié pour les neurosciences ou la physiologie laboratoires d'enseignement.
La préparation de la chute est utile pour étudier la fonction des identifiable (sensoriel, moteur et inter-neurones dans le système nerveux central de l'animal (SNC). L'propriété utile de neurones de sangsue est que la forme de leurs potentiels d'action et les propriétés biophysiques sont caractéristiques d'un étant donné le type de cellule (par exemple P, N, T, Rz). outre neurones peuvent être retirés de l'animal et on les cultive dans un milieu approprié dans lequel les cellules conservent leurs caractéristiques électriques aussi longtemps que 45 jours 1,2.
Un net avantage du ganglion de sangsue pour apprendre à faire des enregistrements électrophysiologiques est que les cellules sont disposées de manière fiable et caractéristique dans le ganglion dans un modèle qui permet l'identification des types cellulaires distincts de ganglion à ganglion et de l'animal à animal. L'emplacement unique et la morphologie des neurones dans sangsue ganglions ont été notées par Retzius dès 1891 3. Connaissance des el'identité et la fonction d'un neurone e est avantageux pour l'étude des circuits neuronaux et pour faire des expériences avec un type cellulaire donné. En raison de la relativement grande soma des neurones dans un ganglion qu'ils sont visibles avec un microscope à dissection, et les corps cellulaires peuvent être empalées sélectivement avec des microélectrodes pour l'enregistrement de leurs propriétés électriques.
Des colorants et des grosses molécules peuvent être injectés dans les cellules individuelles et les propriétés de canal étudié par patch-clamp. Courants ioniques qui donnent naissance aux différentes formes des potentiels d'action des neurones dans les différentes caractéristiques ont été identifiées 4-7. Des enquêtes dans le modèle de l'innervation et la ramification des neurones individuels dans le système nerveux central, les connexions synaptiques ont été reproduits dans la culture de neurones identifiés 2,8. Les études dans les ganglions de la chute ont permis de mieux comprendre le développement de circuits fonctionnels qui peut être mesurée avec électrophysiologie ainsi qu'avec grose comportement animal des études. La sangsue CNS a aussi été une préparation précieuse pour les mécanismes impliqués dans la réparation et la régénération neuronale chez l'animal entier et dans la culture 4-6,9-12 enquête.
Dans le cerveau des mammifères est une tâche ardue pour expliquer le comportement en termes de propriétés et les connexions de neurones identifiés individuels. En principe, on peut espérer que l'étude des systèmes moins complexes tels que la chute pourrait aider à définir des mécanismes de base utilisés chez les animaux supérieurs. Les connexions qui sont utilisées qui sous-tendent un modèle de natation 13,14 et la rythmicité du cœur 15 ont été bien caractérisés dans la chute. La capacité de certains neurones de sangsue à former à la fois la communication électrique et chimique est intrigante. Certaines connexions sont bidirectionnelles tandis que d'autres sont unidirectionnels chimiquement mais bidirectionnel électriquement 7. Comprendre les connexions synaptiques dans l'animal ainsi que de recréer la même type de connexions dans une boîte de culture sont des outils puissants pour enquêter sur la synaptogenèse 16-18 ainsi que le profilage pharmacologique de synapses 19. Les techniques d'enregistrement et de stimulation intracellulaires décrites ici constituent une base pour les essais pharmacologiques et la recherche dans neuroéthologie et le développement.
En outre, le segment chaîne nerveuse ventrale peut être disséqué avec un morceau de peau innervée. Avec la possibilité de garder un morceau de peau et les neurones en vie, les champs récepteurs sensoriels peuvent être sondés par l'enregistrement de signaux électriques du corps cellulaire (c.-à-soma) des neurones sensoriels dans ganglion abdominal respective dans le SNC. Ainsi, on peut évaluer la sensibilité des terminaisons sensorielles en appliquant différents degrés de force sur la peau et la carte des champs récepteurs: légèreté, la pression et nuisible (douloureuse) stimuli 20,21.
Un avantage de cette sangsue préparation ganglion-peau, c'est un can dessiner anatomiquement la carte de champ récepteur et tracer les processus neuronaux au neurone identifié une fois que les réponses électriques sont enregistrées. Les trois expériences de sangsues décrites ci-dessous peuvent tous être remplis plusieurs fois avec un seul spécimen, ce qui en fait un module d'enseignement rentable pour les laboratoires universitaires.
Le but de cette série d'expériences était de 1) pour enseigner et exposer les principes fondamentaux d'enregistrements intracellulaires de neurones identifiables et 2) de reconnaître les formes caractéristiques des signaux électriques qui peuvent découler de ces types de neurones particuliers à l'aide de sangsues pour adultes. Il ya une riche histoire des enquêtes en utilisant la chute des enquêtes neurophysiologiques et de la recherche est en cours dans le traitement des questions de circuits neuronaux et la régulation des gènes au cours du développement ainsi que lors de la réparation synaptique et la régénération 10. Neuromodulation, notamment par des voies d'amines biogènes, a également été une direction de recherche fructueuse dans la chute. En ajoutant de la dopamine et d'autres agents pharmacologiques sur le système nerveux à travers la solution saline, il a été montré que la dopamine module réseaux neuronaux impliqués dans 23 les schémas moteurs et pour l'analyse du comportement de prise de décision 24,25. Cette approche expérimentale est un simple (et peu coûteux) façon d'intégrer la modulation dans le laboratoire d'enseignement, et en ajustant la composition ionique de la solution saline est un moyen efficace d'enseigner les équations de Nernst et Goldman-Hodgkin-Katz.
Pour avoir du succès avec les préparations ganglionnaires il est important d'avoir le ganglion tendu avant de tenter de percer un soma avec une électrode intracellulaire. Sinon, le soma se déplace lorsque l'on pousse sur le paquet gliales. En outre, lorsque le ganglion dégainage pour enlever les neurones de la culture, d'éviter la région d'intérêt lors de la coupe à travers le ganglion si somas ne sont pas endommagés, ils sont supprimés. En outre, l'incubation excessive dans les enzymes peut entraîner les neurones étant trop fragiles pour être enlevé. Il nécessite quelques essais et erreurs pour atteindre un temps d'incubation idéal parce que chaque série d'enzymes est légèrement différent dans leurs actions.
Une enquête plus poussée pour optimiser les milieux de culture pourrait améliorer cette technique. VariUO facteurs, tels que la présence d'insuline, de sucres, ou des facteurs de croissance pourraient être examinés pour l'entretien des cultures plus. Pour déterminer si les cellules conservent leur capacité à synthétiser des transmetteurs, tels que la synthèse de la sérotonine dans les cellules Rz, coloration au rouge neutre peut être appliquée à étiqueter processus sérotoninergiques. Invasion aussi la microglie à tissu lésé et la régénération peut être quantifiée par des taches nucléaires jours après une blessure.
Bien que cette préparation a de nombreux avantages à offrir en examinant la régénération et la réparation, ainsi que les circuits neuronaux, l'identification pharmacologique et moléculaire des différents sous-types de récepteurs au niveau des synapses n'ont pas été pleinement caractérisé. Une bibliothèque de marqueur de séquence exprimée est disponible 26, et le génome de la sangsue médicinale est actuellement en cours d'assemblage 27, mais la principale limitation à la sangsue par rapport à certaines préparations à base de modèle est la capacité de modifier le génome de gènes sélectifs dans des types cellulaires spécifiques. En embryons tsa restriction a été revue par l'injection d'ADN ou ARN double brin pour réguler l'expression de gènes 28. La technique de canon à gènes a été récemment utilisée pour exprimer la connexine invertébrés (de innexin) de protéines dans les neurones de sangsue. Expression d'un innexin de Hirudo verbana (HVE inx6) est suffisante pour la formation de jonctions lacunaires ectopiques dans la sangsue médicinale 29. La sangsue médicinale ou H. verveine que c'était 30 est sûr de faire progresser notre compréhension de la physiologie et de l'évolution des synapses électriques au cours des prochaines années.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |