यह लेख जोंक का उपयोग कर तीन तंत्रिका तंत्र की तैयारी का वर्णन: intracellular रिकॉर्डिंग उदर ganglia में न्यूरॉन्स से, उदर गैन्ग्लिया से संवर्धन न्यूरॉन्स, और संवेदी क्षेत्रों को मैप करने innervated त्वचा के एक पैच से रिकॉर्डिंग.
मीठे पानी जोंक, Hirudo medicinalis, Neurophysiology, neuroethology, जीव विज्ञान और विकास के क्षेत्र में वैज्ञानिक सवालों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक बहुमुखी मॉडल जीव है. इस रिपोर्ट का लक्ष्य अन्य तंत्रिका तंत्र की तैयारी में विशेषज्ञता के साथ physiologists को फायदा नहीं होगा, या कम या कोई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुभव के साथ जीव विज्ञान के छात्रों के लिए है कि एक ही लेख में जोंक प्रणाली से प्रयोगात्मक तकनीकों को मजबूत करने के लिए है. हम नाड़ीग्रन्थि में पहचान तंत्रिका सर्किट से intracellularly रिकॉर्डिंग के लिए जोंक काटना कैसे प्रदर्शित करता है. अगला हम जानते समारोह की व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक पेट्री डिश में संवर्धित किया जाना है नाड़ीग्रन्थि, और कैसे संस्कृति में उन न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने से हटाया जा सकता है कि कैसे दिखा. तो फिर हम संवेदी या मोटर क्षेत्रों मानचित्रण के लिए प्रयोग की जाने वाली innervated त्वचा के एक पैच तैयार करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. ये जोंक की तैयारी अभी भी व्यापक रूप से तंत्रिका networ के बुनियादी बिजली के गुणों का पता करने के लिए उपयोग किया जाता हैएस, व्यवहार, synaptogenesis, और विकास. उन्होंने यह भी तंत्रिका विज्ञान या शरीर क्रिया विज्ञान शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक उपयुक्त प्रशिक्षण मॉड्यूल हैं.
जोंक तैयारी पहचान योग्य (संवेदी, मोटर और जानवर के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर अंतर – न्यूरॉन्स के समारोह की जांच के लिए उपयोगी है. जोंक न्यूरॉन्स की उपयोगी संपत्ति उनके कार्रवाई क्षमता और biophysical गुणों का आकार एक के लिए विशेषता यह है कि सेल प्रकार दिया (यानी पी, एन, टी, RZ). इसके अलावा न्यूरॉन्स कोशिकाओं के रूप में लंबे समय के 45 दिनों 1,2 रूप के लिए उनके बिजली विशेषताओं को बनाए जिसमें एक उपयुक्त माध्यम में पशु और सुसंस्कृत से हटाया जा सकता है.
Electrophysiological रिकॉर्डिंग बनाने के लिए सीखने के लिए जोंक नाड़ीग्रन्थि की एक विशिष्ट लाभ कोशिकाओं विशेषता से और मज़बूती से अनुमति देता है कि एक पैटर्न में नाड़ीग्रन्थि में व्यवस्थित कर रहे हैं कि है नाड़ीग्रन्थि से नाड़ीग्रन्थि करने और जानवर से जानवर के लिए अलग सेल प्रकार की पहचान. अद्वितीय स्थान और जोंक ganglia में न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान के रूप में जल्दी 1891 के रूप में 3 Retzius द्वारा नोट कर रहे थे. वें का ज्ञानई पहचान और एक न्यूरॉन के समारोह तंत्रिका सर्किट की जांच के लिए और एक दिया सेल प्रकार के साथ प्रयोग करने के लिए लाभप्रद है. कारण वे एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ दिखाई दे रहे हैं, और somata चुनिंदा उनके बिजली के गुणों की रिकॉर्डिंग के लिए microelectrodes साथ impaled जा सकता है एक नाड़ीग्रन्थि भीतर न्यूरॉन्स के अपेक्षाकृत बड़े somata के लिए.
रंगों और बड़े अणुओं व्यक्ति की कोशिकाओं और पैच दबाना द्वारा अध्ययन चैनल गुणों में इंजेक्ट किया जा सकता है. विभिन्न न्यूरॉन्स में विशेषता कार्रवाई क्षमता की विभिन्न आकृतियों को जन्म दे कि आयोनिक धाराओं 4-7 पहचान की गई है. स्फूर्तिदान के पैटर्न और सीएनएस के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की शाखाओं में बंटी में जांच से, synaptic कनेक्शन की पहचान की न्यूरॉन्स 2,8 के साथ संस्कृति में reproduced किया गया है. जोंक ganglia में अध्ययन whol के साथ के साथ ही इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से मापा जा सकता है कि कार्यात्मक सर्किट के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान की हैई पशुओं के व्यवहार के अध्ययन. जोंक सीएनएस भी पूरी पशुओं में और संस्कृति 4-6,9-12 में neuronal मरम्मत और उत्थान के साथ शामिल तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान तैयारी के रूप में सेवा की है.
स्तनधारी दिमाग में यह गुण और व्यक्तिगत पहचान की न्यूरॉन्स के कनेक्शन के मामले में व्यवहार की व्याख्या करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है. सिद्धांत रूप में ऐसा ही एक जोंक के रूप में कम जटिल प्रणालियों का अध्ययन उच्च पशुओं में इस्तेमाल बुनियादी तंत्र को परिभाषित करने के लिए मदद कर सकता है उम्मीद कर सकते हैं. तैरने के पैटर्न 13,14 और दिल 15 की rhythmicity आबाद जो उपयोग किया जाता है कि कनेक्शन अच्छी तरह से जोंक में विशेषता किया गया है. दोनों बिजली और रासायनिक संचार फार्म के लिए कुछ जोंक न्यूरॉन्स की क्षमता पेचीदा है. दूसरों यूनिडायरेक्शनल रासायनिक लेकिन द्विदिश विद्युत 7 रहे हैं, जबकि कुछ कनेक्शन द्विदिश हैं. पशु भीतर synaptic कनेक्शन को समझना है और साथ ही एक ही typ पुनः बनानेएक संस्कृति डिश में कनेक्शनों की ई synaptogenesis 16-18 के साथ ही synapses 19 के औषधीय रूपरेखा की जांच के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं. यहाँ वर्णित intracellular रिकॉर्डिंग और उत्तेजना तकनीक neuroethology और विकास में औषधीय assays और अनुसंधान के लिए एक आधार प्रदान करते हैं.
इसके अलावा, कमानी उदर तंत्रिका कॉर्ड innervated त्वचा के एक पैच के साथ विच्छेदित किया जा सकता है. जिंदा त्वचा के एक पैच और न्यूरॉन्स रखने की क्षमता के साथ, संवेदी ग्रहणशील क्षेत्रों सीएनएस में संबंधित पेट नाड़ीग्रन्थि भीतर संवेदी न्यूरॉन्स सेल शरीर (यानी सोमा) से विद्युत संकेतों की रिकॉर्डिंग के द्वारा जांच की जा सकती. जिससे एक त्वचा पर बल की डिग्री बदलती लगाने से संवेदी अंत की संवेदनशीलता का आकलन और ग्रहणशील क्षेत्रों नक्शा कर सकते हैं: हल्के स्पर्श, दाब, और हानिकारक (दर्दनाक) 20,21 उत्तेजनाओं.
इस जोंक नाड़ीग्रन्थि त्वचा तैयारी का एक लाभ यह है कि एक सीएn anatomically ग्रहणशील क्षेत्र नक्शा तैयार और बिजली प्रतिक्रियाएं दर्ज किया जा रहा है एक बार पहचान न्यूरॉन को neuronal प्रक्रियाओं का पता लगा. नीचे वर्णित तीन जोंक प्रयोगों सभी शैक्षणिक प्रयोगशालाओं के लिए यह एक लागत प्रभावी शिक्षण मॉड्यूल बनाता है जो एक भी नमूना, के साथ कई बार पूरा किया जा सकता है.
प्रयोगों के इस सेट का उद्देश्य 1) को पढ़ाने और प्रदर्शन intracellular रिकॉर्डिंग के मौलिक सिद्धांतों पहचान योग्य न्यूरॉन्स से और 2) वयस्क जोंक का उपयोग विशेष रूप से इन neuronal प्रकार से पैदा कर सकते हैं कि विद्युत संकेतों की विशेषता आकृतियों को पहचान करने के लिए किया गया था. वहाँ neurophysiological जांच के लिए जोंक का उपयोग कर जांच की एक समृद्ध इतिहास है और अनुसंधान तंत्रिका circuitry और विकास के दौरान और साथ ही synaptic मरम्मत और उत्थान 10 के दौरान जीन विनियमन के सवालों के समाधान में चल रही है. Neuromodulation, विशेष रूप से biogenic amine रास्ते के माध्यम से, यह भी जोंक में एक सफल शोध दिशा किया गया है. खारा समाधान के माध्यम से तंत्रिका तंत्र के लिए डोपामाइन और अन्य औषधीय एजेंटों को जोड़ कर, यह डोपामाइन निर्णय लेने व्यवहार 24,25 रेंगने के लिए 23 और मोटर पैटर्न में शामिल तंत्रिका नेटवर्क modulates कि दिखाया गया है. इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक भोला आदमी हैLe (और सस्ती) शिक्षण प्रयोगशाला में मॉडुलन शामिल करने का रास्ता है, और खारा समाधान के आयनिक श्रृंगार एडजस्ट नेर्न्स्ट और गोल्डमैन है Hodgkin-Katz समीकरणों को पढ़ाने के लिए एक कारगर तरीका है.
नाड़ीग्रन्थि तैयारी के साथ सफल होने के लिए यह नाड़ीग्रन्थि पिछले एक intracellular इलेक्ट्रोड के साथ एक सोमा प्रहार करने का प्रयास करने के लिए तना हुआ होना बहुत जरूरी है. Glial पैकेट पर नीचे धक्का जब अन्यथा सोमा कदम होगा. संस्कृति के लिए न्यूरॉन्स को दूर करने के लिए नाड़ीग्रन्थि desheathing जब वे निकाल रहे हैं के रूप में SOMAS क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं तो नाड़ीग्रन्थि पार काटने जब इसके अलावा, ब्याज के क्षेत्र से बचें. इसके अलावा, एंजाइमों में अत्यधिक ऊष्मायन न्यूरॉन्स हटा दिया जाना भी कमजोर किया जा रहा है में हो सकता है. यह एंजाइमों के प्रत्येक बैच उनके कार्यों में थोड़ा अलग है क्योंकि एक आदर्श ऊष्मायन समय हासिल करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता है.
संस्कृति मीडिया अनुकूलन करने के लिए आगे की जांच के लिए इस तकनीक में सुधार सकता है. वारीइंसुलिन, शक्कर, या वृद्धि कारकों की उपस्थिति के रूप में ous कारकों, संस्कृतियों के लंबे समय तक रखरखाव के लिए जांच की जा सकती है. कोशिकाओं Rz कोशिकाओं में सेरोटोनिन संश्लेषण के रूप में ट्रांसमीटरों, synthesize करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए तय अगर, तटस्थ लाल धुंधला serotonergic प्रक्रियाओं लेबल करने के लिए लागू किया जा सकता है. घायल और regenerating ऊतकों को भी microglial आक्रमण एक चोट के बाद परमाणु दाग दिनों द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
इस तैयारी उत्थान और मरम्मत के साथ ही तंत्रिका circuitry की जांच में की पेशकश करने के कई फायदे हैं हालांकि, synapses पर विभिन्न रिसेप्टर subtypes के औषधीय और आणविक पहचान पूरी तरह से नहीं किया गया विशेषता है. एक व्यक्त अनुक्रम टैग पुस्तकालय 26 उपलब्ध है, और औषधीय जोंक जीनोम वर्तमान में 27 इकट्ठा किया जा रहा है, लेकिन कुछ मॉडल तैयारी की तुलना में जोंक में मुख्य सीमा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में चयनात्मक जीनों के लिए जीनोम को संशोधित करने की क्षमता है. भ्रूण टी मेंउसकी सीमा जीन अभिव्यक्ति 28 को विनियमित करने के लिए डीएनए या dsRNA इंजेक्शन लगाने के द्वारा संबोधित किया गया है. जीन बंदूक तकनीक हाल ही में जोंक न्यूरॉन्स में दब्बू connexin (innexin) प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Hirudo verbana (hve-inx6) से एक innexin की अभिव्यक्ति औषधीय जोंक 29 में अस्थानिक अंतराल जंक्शनों के गठन के लिए पर्याप्त है. औषधीय जोंक या एच. यह 30 के रूप में थे verbena अगले कुछ वर्षों में शरीर विज्ञान और विद्युत synapses के विकास की हमारी समझ अग्रिम करने के लिए यकीन है.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |