Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión
Summary
Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) pueden auto-renovarse y diferenciarse en neuronas y células gliales. NSCs trasplantados pueden reemplazar las neuronas perdidas y glía después de la lesión de la médula espinal (SCI), y pueden formar relés funcionales para volver a conectar los segmentos de la médula espinal por encima y por debajo de la lesión. Estudios previos de injerto de las células madre neurales han sido limitados por incompleta la supervivencia del injerto dentro de la cavidad de la lesión de la médula espinal. Además, el seguimiento de la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación, y la extensión proceso no había sido optimizada. Finalmente, en estudios previos, se registraron típicamente NSC de rata en cultivo para diferenciarse en glía cuando injertado a la médula espinal lesionada, en lugar de las neuronas, a menos que el destino se debió a un tipo específico de célula. Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado nuevos métodos para mejorar la supervivencia, la integración y la diferenciación de NSC a sitios de incluso severa SCI. NSC estaban recién aisladas de embriones día 14 la médula espinal (E14) desde una línea transgénica de ratas Fischer 344 estable que expresa fl verdeproteína uorescente (GFP) y se incrusta dentro de una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento; esta formulación destinada a conservar las células injertadas en la cavidad de la lesión y apoyar la supervivencia celular. NSCs en el cóctel factor de fibrina / crecimiento se implantaron dos semanas después torácica nivel 3 (T3) completos transección de la médula espinal, lo que evita los períodos pico de la inflamación. Injertos resultantes llenan completamente la cavidad de la lesión y se diferenciaron en neuronas tanto, que se extendían los axones en el huésped de la médula espinal sobre notablemente largas distancias, y glía. Los injertos de NSCs humanos cultivados que expresan GFP produjeron resultados similares. Por lo tanto, los métodos se definen para la mejora de injerto neural de células madre, la supervivencia y el análisis de los resultados in vivo.
Introduction
Lesión de la médula espinal (SCI) a menudo daños no sólo tractos de sustancia blanca que llevan señales desde y hacia el cerebro, sino también la materia gris central, causando la pérdida segmentaria de interneuronas y las neuronas motoras. La consecuencia de la lesión medular es la pérdida de tanto la función motora y sensorial por debajo de la lesión. Desafortunadamente, el sistema nervioso central adulto (SNC) no espontáneamente a regenerar, dando como resultado déficits funcionales permanentes 1. Por lo tanto, la reconstrucción de la lesionada médula espinal adulta y la mejora de motor, sensorial y la función autonómica es un objetivo importante de la investigación de SCI. Las células madre neurales (NSC), ya sea directamente aislada de embrionarias o adultas del SNC, son células candidatos de peso para reemplazar las neuronas perdidas y glía. Por otra parte, estas células tienen el potencial para formar nuevos enlaces funcionales para restaurar la conducción axonal a través de un 2,3 sitio de la lesión.
Hasta la fecha, no ha habido una elucidación detallada de la anatómica, electrophysiológica y efectos en el comportamiento de la formación de relé neuronal por NSCs trasplantados después severa SCI. Hay varias razones para esto: primero, NSCs trasplantados o tejido fetal CNS sobrevivir mal cuando se injertan en grandes cavidades de la lesión. Estudios previos muestran una pérdida sustancial de células temprano, dejando grandes cavidades lesión quística vacías 4,5. En algunos estudios, las células injertadas serían posteriormente se dividen y se llenan la cavidad de la lesión de 4,5, pero esto puede ocurrir después de un retraso de días o semanas, y posterior llenado sitio de la lesión podría no ser completa o coherente. En segundo lugar, un sistema de seguimiento eficaz que proporciona datos fiables sobre la supervivencia celular, la diferenciación / maduración, y el crecimiento de NSCs trasplantados era deficiente. La mayoría de los estudios iniciales utilizados anterógrada y retrógrada etiquetado para rastrear las proyecciones axonales de trasplantes de 2,3. Sin embargo, estas técnicas sólo parcialmente y, a menudo proyecciones axonales poco clara etiquetados derivados de células injertadas, y métodos de trazadores son subjetivost de artefactos causados por fugas de tinte más allá de las células implantadas. Otros grupos utilizan marcadores neuronales específicos humanos para etiquetar las proyecciones axonales después del trasplante de NSC fetales humanos en roedores lesionada de la médula espinal 5,6. Sin embargo, en estos estudios, los xenoinjertos no sobrevivieron consistentemente bien. Recientemente, se utilizó la entrega viral del gen reportero GFP para etiquetar NSC cultivadas 7,8. Sin embargo, la expresión de GFP fue a menudo incoherente y puede ser regulado a la baja 7. Recientemente, el uso de ratones donantes transgénicas o ratas de forma estable que expresan el gen reportero, GFP, o la fosfatasa alcalina de placenta humana, ha mejorado espectacularmente el seguimiento de los trasplantados neurales células madre / progenitoras in vivo 9,11. En tercer lugar, varios estudios indican que in vitro NSCs rata cultivadas derivadas de cualquiera embrionarias o adultas del SNC se diferencian exclusivamente en linajes gliales cuando se trasplantan en el medio de la cor espinal adulta intacta o lesionadad 7,12,13, a pesar del hecho de que estas células madre neurales son capaces de diferenciarse en neuronas y glía tanto in vitro, lo que indica que los entornos locales pueden dictar el destino de las células madre. Alternativamente, NSC cultivadas, especialmente los derivados de SNC adulto, pueden tener propiedad intrínseca defaulty de diferenciarse en linajes gliales in vivo 13.
Debido a las limitaciones mencionadas anteriormente, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un nuevo protocolo para mejorar embrionario seguimiento NSC, la supervivencia y la diferenciación / maduración en el adulto con lesiones graves de la médula espinal. En pocas palabras, empezamos con una línea transgénica Fischer 344 ratas inbreed estable que expresa un gen reportero GFP que sustenta la expresión de GFP después in vivo del trasplante 14. A continuación, se utilizó NSC recién aisladas de día embrionario 14 Fischer 344 de la médula espinal, una etapa de desarrollo que conserva el potencial de generar ambas neuronas y glía. Finalmente, inmersosNSCs recién disociadas en una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento 15-17 para retener las células y distribuir uniformemente dentro de una gran cavidad de la lesión, con el objetivo de apoyar la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación y la integración. Los injertos se colocan en sitios de T3 transección completa, dos semanas después de la lesión de la médula espinal. Estas células injertadas llenan constantemente sitios transección completa y diferenciarse en neuronas abundantes que se extendía un gran número de axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias 18. Se obtuvieron resultados similares usando cultivadas injertos de células madre neurales humanas a inmunodeficientes ratas 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los principales obstáculos para la NSC el trasplante de la médula espinal lesionada es pobre supervivencia en el centro de la lesión. Todos los huecos o cavidades en el sitio de la lesión potencialmente podrían reducir o disminuir la formación de relés neuronales funcionales entre axones supraespinales y segmentos de la médula espinal separados por debajo de la lesión. Además, la mala supervivencia de NSCs injertadas puede afectar a su integración con el tejido del huésped, y por lo tanto reducir la c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Rata de Recursos y Centro de Investigación de la Universidad de Missouri, Columbia, Missouri, para proporcionar ratas GFP; Neuralstem Inc. para proporcionar células madre neurales humanas. Este trabajo fue apoyado por la Administración de Veteranos, el NIH (NS09881), la Organización Canadiense de Investigación espinal, la Fundación Craig H. Neilsen, y Bernard y Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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