重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進
Summary
増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。
Abstract
神経幹細胞（NSCは）自己再生および神経細胞とグリアに分化することができる。移植されたNSCは、脊髄損傷（SCI）後に失われたニューロンおよびグリアを置き換えることができ、かつ病変の上下脊髄セグメントを再接続するために、機能のリレーを形成することができる。神経幹細胞を移植する以前の研究は、脊髄病変キャビティ内の不完全な移植片の生存によって制限されている。さらに、移植細胞の生存、分化、および処理延長の追跡は、最適化されていなかった。運命は、特定の細胞型に牽引された場合を除き、最終的に、これまでの研究では、培養したラットのNSCは、一般的に、むしろ神経細胞よりも、損傷した脊髄に移植された際にグリアに分化することが報告された。これらの問題に対処するために、我々は、生存率を改善するために過酷なSCIの部位へのNSCの統合および分化を新たな方法を開発した。 NSCは新たにグリーンFLを発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットラインから胎生14日目の脊髄（E14）から単離したuorescentタンパク質（GFP）および成長因子を含有するフィブリンマトリックスに埋め込まれた;病変空洞内に移植された細胞を保持し、細胞生存を支持することを目的としたこの製剤。フィブリン/成長因子カクテル中のNSC、それによって炎症のピーク期間を避けて、二週間胸椎レベル3（T3）完全な脊髄離断後に移植した。その結果移植片は完全に病変空洞を充填して著しく長い距離、およびグリアを介してホスト脊髄に軸索を拡張し、両方のニューロンに分化した。 GFPを発現する培養ヒトNSCの移植片は同様の所見が得られた。したがって、方法は、神経幹細胞移植、生存およびインビボ所見の分析を改善するために定義されている。
Introduction
脊髄損傷（SCI）は、しばしば損害だけでなく、ニューロンと運動ニューロンのセグメント損失を引き起こす脳との間で信号を運ぶ白質路ではなく、中心灰白質、。 SCIの結果、モータおよび病変以下感覚機能の両方の喪失である。残念ながら、成人の中枢神経系（CNS）は、自然発生的に恒久的な機能欠損1で、その結果、再生成されません。そのため、運動、感覚および自律神経機能で負傷し、成人脊髄および改善の再構成はSCIの研究の重要な目標である。神経幹細胞（NSC）、直接、胚または成体CNSから単離されたかどうか、失われたニューロンおよびグリアを置き換えるために魅力的な候補細胞である。さらに、これらの細胞は損傷部位の2,3横切っ軸索伝導を回復するために新たな機能のリレーを形成する可能性を有する。
今日まで、解剖学的、electrophysの詳細な解明がなされていないiological、重度の脊髄損傷後に移植するNSCによる神経の中継形成の行動への影響。これにはいくつかの理由があります。大規模な病変空洞に移植する際、最初に移植されたNSCまたは胎児CNS組織が不十分生き残る。これまでの研究では、大規模な空の嚢胞性病変キャビティ4,5を残して、かなり初期のセル損失を示しています。いくつかの研究では移植された細胞はその後分裂し、病変空洞に4,5を満たしたが、これは数日から数週間の遅延の後に発生する可能性がある、とその後の病変部位の充填は、完全または一貫性がない可能性がありますでしょう。第二に、細胞の生存、分化/成熟、および移植されたNSCの成長に音声データを提供する効率的な追跡システムが欠けていた。最も初期の研究では、移植の2,3からの軸索投射をトレースする順行と逆行性標識を利用した。しかしながら、これらの技術は、部分的にのみ、しばしば不鮮明に移植された細胞から生じる軸索投射を標識し、トレーサー法は主観である移植された細胞を超えて色素漏出に起因するアーティファクトにトン。他のグループは、負傷した齧歯類の脊髄5,6にヒト胎児NSCの移植後の軸索投射にラベルを付けるために、人間の特定のニューロンのマーカーを使用していました。しかし、これらの研究では、 異種移植は一貫してうまく生存しなかった。最近では、GFPレポーター遺伝子のウイルス送達は、培養されたNSCの7,8を標識した。しかし、GFP発現は、しばしば矛盾していたと7をダウンレギュレートすることができる。近年、安定してレポーター遺伝子、GFP、又はヒト胎盤アルカリホスファターゼを発現するトランスジェニックドナーマウスまたはラットの使用は、劇的にインビボ 9,11 における移植神経幹細胞/前駆細胞のトラッキングを改善した。第三に、いくつかの研究は、そのまま、または負傷した成人の脊髄CORの環境に移植されたときのどちらか胚または成体CNSから派生したin vitroで培養したラットのNSCは、独占的にグリア系統に分化することを示すdは7,12,13、これらの神経幹細胞は、ローカル環境が幹細胞の運命を決定することができることを示す、 インビトロの両方でニューロンおよびグリアに分化することができるという事実にもかかわらず。あるいは、培養されたNSCは、成体CNS由来特には、 インビボ 13 におけるグリア系譜に分化する固有のdefaulty性を有していてもよい。
そのため、上述の制限のため、我々のグループは最近、重傷を負った成人の脊髄の胚性NSCの追跡、生存および分化/成熟を改善するために新しいプロトコルを開発しました。簡単に言えば、我々は、生体内移植後の14 GFPの発現を維持GFPレポーター遺伝子を発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットの近親交配するラインから始まりました。次に、我々は日胚から14フィッシャー344脊髄、神経細胞とグリアの両方を生成する可能性を保持している開発の段階を新たに単離したNSCを使用していました。最後に、組み込み増殖を含むフィブリンマトリックス中へ新たに解離されたNSCは、移植細胞の生存、分化および統合をサポートすることを目指し、細胞を保持し、均一に大きな病変キャビティ内にそれらを配布する15-17因子 。移植片は、完全な離断T3、脊髄損傷後2週間の部位に配置した。これらの移植された細胞は、一貫して完全な離断サイトを満たし、長い距離18を介してホスト脊髄への軸索の多数を拡張し、豊富な神経細胞に分化した。同様の結果は、免疫不全ラット18まで培養ヒト神経幹細胞移植片を用いて得た。
Protocol
Representative Results
Discussion
損傷した脊髄内のNSC移植のための主要な障害の1つは、病変の中心部での低い生存率である。病変部位にギャップまたはキャビティは、潜在的に軽減または脊柱上軸索と傷害下の分離された脊髄セグメント間の機能的神経細胞のリレーの形成を弱める可能性があります。また、グラフトされたNSCの生存率不良が宿主組織との統合に影響を与えるので、ホストニューロンとニューロンのグラフト…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、GFPラットを提供するために、ミズーリ州、ミズーリ州、コロンビア大学、ラット資源研究センターに感謝。 Neuralstem社ヒト神経幹細胞を提供する。この作品は、退役軍人、NIH（NS09881）、カナダの脊髄研究機構、クレイグ·H·ニールセン財団、バーナード、アンネスピッツァー公益信託によってサポートされていました。
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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