Promozione della sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali con fibrina e fattore di crescita Cocktails dopo gravi lesioni del midollo spinale
Summary
Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in neuroni e glia. NSC trapiantate possono sostituire i neuroni persi e glia dopo la lesione del midollo spinale (SCI), e possono formare relè funzionali di ri-collegare segmenti del midollo spinale sopra e sotto una lesione. Precedenti studi innesto cellule staminali neurali sono stati limitati dalla sopravvivenza dell'innesto incomplete all'interno del midollo spinale cavità lesione. Inoltre, il monitoraggio della sopravvivenza cellulare dell'innesto, differenziazione, e l'estensione processo non era stata ottimizzata. Infine, in studi precedenti, NSC ratto coltivate erano tipicamente riferite a differenziarsi in cellule gliali quando innestato al midollo spinale danneggiato, piuttosto che neuroni, salvo destino è stato guidato per un tipo cellulare specifico. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato nuovi metodi per migliorare la sopravvivenza, l'integrazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali ai siti di ancora grave SCI. NSC sono stati appena isolati da embrionale giorno 14 del midollo spinale (E14) da un transgenico Fischer 344 linea di ratto stabile esprimere fl verdeuorescente proteina (GFP) e sono stati incorporati in una matrice di fibrina contenente fattori di crescita; questa formulazione mirava a conservare cellule innestate nella cavità lesione e supportare la sopravvivenza cellulare. NSC in fibrina / fattore di crescita cocktail sono stati impiantati due settimane dopo toracico livello 3 (T3) completi transections midollo spinale, evitando periodi di picco di infiammazione. Innesti risultanti completamente riempito la cavità della lesione e differenziate in entrambi i neuroni, che si estendevano assoni nell'ospite midollo spinale sopra straordinariamente lunghe distanze, e glia. Innesti di cellule staminali neurali umane in coltura che esprimono GFP portato a risultati simili. Così, i metodi sono definiti per migliorare neurale innesto di cellule staminali, la sopravvivenza e l'analisi dei risultati in vivo.
Introduction
Lesioni del midollo spinale (SCI), spesso danni non solo tratti di sostanza bianca che trasportano i segnali da e verso il cervello, ma anche la materia grigia centrale, causando la perdita segmentale degli interneuroni e motoneuroni. La conseguenza di SCI è perdita sia funzioni motorie e sensoriali sotto della lesione. Purtroppo, il sistema nervoso centrale adulto (CNS) non rigenera spontaneamente, con conseguente deficit funzionali permanenti 1. Pertanto, la ricostruzione dei feriti midollo spinale adulto e il miglioramento in motoria, sensoriale e della funzione autonomica è un obiettivo importante della ricerca SCI. Cellule staminali neurali (NSC), sia direttamente isolata da embrionale o adulto CNS, sono cellule candidati validi per sostituire i neuroni perduti e glia. Inoltre, queste cellule hanno il potenziale di formare nuovi relè funzionali per ripristinare conduzione assonale attraverso un 2,3 sito della lesione.
Ad oggi, non c'è stata una spiegazione dettagliata del anatomica, electrophysiological ed effetti comportamentali della formazione relè neuronale da cellule staminali neurali trapiantate dopo il grave SCI. Ci sono diverse ragioni per questo: primo, NSC trapiantati o fetale del tessuto del sistema nervoso centrale sopravvivere male quando innestati in grandi cavità della lesione. Precedenti studi mostrano sostanziale perdita di cellule presto, lasciando grandi cavità lesione cistica vuoti 4,5. In alcuni studi le cellule innestate dovessero successivamente dividono e riempire la cavità lesione 4,5, ma questo potrebbe verificarsi dopo un ritardo di giorni o settimane, e successivo riempimento sito della lesione non sia completa o coerente. In secondo luogo, un sistema di monitoraggio efficiente che fornisce dati attendibili sulla sopravvivenza cellulare, differenziamento / maturazione, e di conseguenza trapiantato cellule staminali neurali era carente. La maggior parte dei primi studi utilizzati anterograda e retrograda etichettatura per tracciare le proiezioni assonali di trapianti di 2,3. Tuttavia, queste tecniche solo parzialmente e spesso proiezioni assonale poco chiaro etichettati derivanti da cellule innestate e metodi traccianti sono soggettivit di artefatti di perdite di colorante oltre le cellule impiantate. Altri gruppi utilizzati marcatori neuronali specifici umane per etichettare proiezioni assonale dopo il trapianto di cellule staminali neurali fetali umani in roditori feriti midollo spinale 5,6. Tuttavia, in questi studi, gli xenotrapianti non hanno sempre sopravvivono bene. Recentemente, la consegna virale del gene reporter GFP è stato usato per etichettare le cellule staminali neurali in coltura 7,8. Tuttavia, l'espressione della GFP era spesso incoerente e può essere down-regolato 7. Recentemente, l'uso di topi o ratti donatori transgenici che esprimono stabilmente il gene reporter GFP, o la fosfatasi alcalina placentare umano, ha notevolmente migliorato l'inseguimento di trapiantate neurali cellule staminali / progenitori in vivo 9,11. In terzo luogo, diversi studi indicano che le cellule staminali neurali di ratto coltivate in vitro derivate da embrioni o adulto CNS differenziano esclusivamente in linee gliali quando trapiantati in ambienti della cor midollo intatto o feriti adultid 7,12,13, nonostante il fatto che queste cellule staminali neurali sono capaci di differenziarsi in neuroni e glia sia in vitro, indicando che ambienti locali possono dettare il destino delle cellule staminali. In alternativa, le cellule staminali neurali in coltura, in particolare quelli derivati da SNC adulto, possono avere intrinseche proprietà defaulty di differenziarsi in linee gliali in vivo 13.
A causa delle limitazioni di cui sopra, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo protocollo per migliorare embrionale inseguimento NSC, la sopravvivenza e la differenziazione / maturazione nel midollo spinale adulto gravemente ferito. In breve, abbiamo iniziato con una linea transgenica Fischer 344 ratti Inbreed stabile che esprime un gene reporter GFP che sostiene espressione GFP dopo il trapianto in vivo 14. Successivamente, abbiamo utilizzato NSC appena isolati dal giorno embrionale 14 Fischer 344 midollo spinale, una fase di sviluppo che mantiene il potenziale per generare sia i neuroni e glia. Infine, si conficcaronoNSC appena dissociate in una matrice di fibrina che contiene fattori di crescita 15-17 per mantenere le cellule in modo uniforme e distribuirli all'interno di una grande cavità della lesione, con l'obiettivo di sostenere la sopravvivenza delle cellule del trapianto, differenziazione e integrazione. Gli innesti sono stati collocati in luoghi di T3 resezione completa, due settimane dopo la lesione del midollo spinale. Queste cellule innestate costantemente riempite siti transezione complete e differenziate in neuroni abbondanti che si estendevano gran numero di assoni in molte midollo spinale su lunghe distanze 18. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando colture di innesti di cellule staminali neurali umane immunodeficienza ratti 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno dei principali ostacoli per NSC trapianto nel midollo spinale danneggiato è scarsa sopravvivenza al centro della lesione. Eventuali lacune o cavità nel sito della lesione potrebbe potenzialmente ridurre o indebolire la formazione di relè neuronali funzionali tra assoni sovraspinali e separati segmenti del midollo spinale al di sotto della lesione. Inoltre, la scarsa sopravvivenza delle cellule staminali neurali trapiantate può influenzare la loro integrazione con il tessuto ospite, e quindi ridurre la connettivi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Resource Rat e Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, per fornire topi GFP; Neuralstem Inc. per la fornitura di cellule staminali neurali umane. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondazione Craig H. Neilsen, e Bernard e Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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