تعزيز بقاء وتمايز الخلايا الجذعية العصبية مع الليفين وعامل نمو الكوكتيلات بعد إصابة الحبل الشوكي الشديدة
Summary
واستخدمت المصفوفات الليفين التي تحتوي على عوامل النمو للاحتفاظ الخلايا الجذعية العصبية المطعمة في مواقع كاملة transection الحبل الشوكي. الخلايا المطعمة شغلها تماما في تجويف الآفة ومتباينة إلى عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية التي امتدت إلى محاور المضيف الحبل الشوكي لمسافات طويلة.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يمكن تجديد الذات والتمايز إلى خلايا عصبية والدبقية. يمكن NSCs زرع الخلايا العصبية المفقودة واستبدال الدبقية بعد إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، ويمكن أن تشكل التبديلات وظيفية لإعادة الاتصال شرائح الحبل الشوكي فوق وتحت الآفة. تم دراسات سابقة التطعيم الخلايا الجذعية العصبية محدودة بسبب بقاء الكسب غير المشروع غير مكتملة داخل تجويف آفة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك، لم تتبع الأمثل للبقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز، وتمديد العملية. أخيرا، في الدراسات السابقة، تم الإبلاغ عن NSCs الفئران مثقف عادة على التمايز إلى الدبقية عندما المطعمة إلى الحبل الشوكي المصاب، بدلا من الخلايا العصبية، إلا إذا كان مدفوعا مصير لنوع من الخلايا المحددة. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا أساليب جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة، والتكامل وتمايز NSCs لمواقع اصابات النخاع الشوكي حتى شديدة. NSCs تم عزل حديثا من الجنينية يوم 14 الحبل الشوكي (E14) من مستقر المعدلة وراثيا فيشر 344 خط معربا عن الفئران الخضراء فلوريداكانت جزءا لا يتجزأ uorescent البروتين (GFP) وإلى المصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو؛ هذه الصيغة تهدف إلى الإبقاء على الخلايا المطعمة في تجويف الآفة ودعم بقاء الخلية. تم زرع NSCs في الليفين / عامل النمو كوكتيل بعد أسبوعين الصدري مستوى 3 (T3) كاملة transections الحبل الشوكي، وبالتالي تجنب فترات الذروة من الالتهابات. الطعوم الناتجة تملأ تجويف تماما الآفة ومتباينة في كل من الخلايا العصبية، الذي مدد محاور في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة بشكل ملحوظ، والدبقية. أدى الطعوم من NSCs الإنسان مثقف التعبير عن GFP في نتائج مماثلة. وبالتالي، يتم تعريف الأساليب لتحسين العصبية ترقيع الخلايا الجذعية والبقاء وتحليل النتائج في الجسم الحي.
Introduction
إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) غالبا ما يضر ليس فقط مساحات بيضاء المسألة التي تحمل إشارات من وإلى الدماغ، ولكن أيضا المادة الرمادية المركزية، مما تسبب في فقدان قطعي من interneurons والخلايا العصبية الحركية. نتيجة لاصابات النخاع الشوكي هو خسارة كل من المحرك وظيفة الحسية تحت الآفة. وللأسف، فإن الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تتجدد من تلقاء أنفسهم، مما أدى إلى عجز وظيفي دائم 1. وبالتالي، وإعادة بناء النخاع الشوكي المصاب الكبار وتحسين المحركات والحسية وظيفة اللاإرادي هو هدف مهم من البحوث اصابات النخاع الشوكي. الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، سواء كانت معزولة مباشرة من الجنينية أو الكبار CNS، هي خلايا مرشح مقنعة لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة والدبقية. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا لديها القدرة على تشكيل التبديلات وظيفية جديدة لاستعادة التوصيل عبر محور عصبي 2،3 موقع الآفة.
حتى الآن، لم يكن هناك توضيح مفصل لالتشريحية، electrophysiological والآثار السلوكية لتشكيل تتابع الخلايا العصبية عن طريق زرع NSCs بعد اصابات النخاع الشوكي الشديدة. هناك عدة أسباب لذلك: أولا، NSCs زرع الجنين أو الأنسجة CNS البقاء على قيد الحياة سيئة عندما المطعمة في تجاويف آفة كبيرة. تظهر الدراسات السابقة فقدان الخلية في وقت مبكر كبيرة، وترك كبيرة فارغة تجاويف الآفة الكيسي 4،5. في بعض الدراسات الخلايا المطعمة ستقسم في وقت لاحق وملء تجويف آفة 4،5، ولكن هذا قد يحدث بعد تأخير لأيام وأسابيع، واللاحقة موقع الآفة ملء قد لا تكون كاملة أو متسقة. الثاني، وهو نظام تتبع فعال التي توفر بيانات سليمة على البقاء على قيد الحياة الخلوية، والتمايز / النضج، وثمرة من زرع NSCs كان مطلوبا. معظم الدراسات المبكرة استخدمت تقدمي ووضع العلامات إلى الوراء لتتبع توقعات محور عصبي من زرع 2،3. ومع ذلك، هذه التقنيات جزئيا فقط، وغالبا ما وصفت التوقعات محور عصبي غير واضح الناشئة من الخلايا المطعمة، وأساليب التتبع هي subjecر إلى التحف التي يسببها تسرب الصبغة خارج الخلايا المزروعة. استخدمت الجماعات الأخرى علامات العصبية محددة الإنسان لتسمية التوقعات محور عصبي بعد زرع الجنين NSCs الإنسان في القوارض إصابة الحبل الشوكي 5،6. ومع ذلك، في هذه الدراسات، وxenografts لم تنج باستمرار أيضا. في الآونة الأخيرة، تم استخدام التسليم الفيروسية من الجين مراسل GFP لتسمية NSCs مثقف 7،8. ومع ذلك، كان GFP التعبير في كثير من الأحيان غير متناسقة ويمكن أسفل ينظم-7. في الآونة الأخيرة، واستخدام الفئران المعدلة وراثيا المانحة أو الفئران معربا عن ثابت الجين المراسل، GFP، أو الفوسفاتيز القلوي المشيمة البشرية، قد تحسنت بشكل كبير تتبع زرع الخلايا الجذعية العصبية / الأسلاف في الجسم الحي 9،11. الثالثة، العديد من الدراسات تشير إلى أن الفئران في المختبر NSCs مثقف المستمدة إما من الجنينية أو الكبار CNS التفريق حصرا في الأنساب الدبقية عند زرعها في الوسط من مجلس النواب الشوكي الكبار سليمة أو جرحواد 7،12،13، على الرغم من أن هذه الخلايا الجذعية العصبية قادرة على التمييز في كل من الخلايا العصبية والدبقية في المختبر، مشيرا إلى أن البيئات المحلية قد تملي مصير الخلايا الجذعية. بدلا من ذلك، NSCs مثقف، لا سيما تلك المتأتية من الجهاز العصبي المركزي الكبار، قد يكون الجوهرية الملكية بواسطة defaulty على التمايز إلى الأنساب الدبقية في الجسم الحي 13.
بسبب القيود التي نوقشت أعلاه، وضعت مجموعتنا مؤخرا بروتوكول جديد لتحسين الجنينية تتبع مجلس الأمن القومي، وبقاء، وتمايز / نضوج الكبار في الحبل الشوكي بجروح بالغة. لفترة وجيزة، بدأنا مع مستقرة المعدلة وراثيا خط فيشر 344 الفئران inbreed تعبر عن الجين مراسل GFP أن يديم GFP التعبير بعد زرع في الجسم الحي 14. المقبل، استخدمنا NSCs معزولة حديثا من يوم الجنينية 14 فيشر 344 الحبل الشوكي، ومرحلة التنمية التي يحتفظ القدرة على توليد كل من الخلايا العصبية والدبقية. أخيرا، ونحن جزءا لا يتجزأ منNSCs فصلها حديثا في مصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو 15-17 الإبقاء على الخلايا وتوزيعها بالتساوي داخل تجويف آفة كبيرة، وتهدف لدعم بقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز والتكامل. وضعت الطعوم في مواقع T3 transection كاملة، بعد أسبوعين من اصابة في الحبل الشوكي. هذه الخلايا المطعمة شغل باستمرار مواقع transection كاملة ومتباينة في الخلايا العصبية وفيرة التي امتدت أعداد كبيرة من محاور عصبية في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة 18. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الطعوم مثقف الخلايا الجذعية العصبية البشرية لنقص المناعة الفئران 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من العقبات الرئيسية لمجلس الأمن القومي في زرع النخاع الشوكي المصاب هو البقاء على قيد الحياة الفقيرة في مركز الآفة. يمكن أي ثغرات أو تجاويف في موقع الآفة يحتمل أن تقلل أو تضعف تشكيل التبديلات العصبية الوظيفية بين محاور عصبية فوق الشوك وفصل شرائح الحبل الشوكي أس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز بحوث الموارد الجرذ و، جامعة ميسوري، كولومبيا، ميزوري، لتوفير الفئران GFP؛ Neuralstem شركة لتوفير الخلايا الجذعية العصبية البشرية. وأيد هذا العمل من قبل إدارة المحاربين القدامى، المعاهد الوطنية للصحة (NS09881)، منظمة البحوث الشوكي الكندي، ومؤسسة نيلسون H. كريغ، وبرنارد والثقة آن سبيتزر الخيرية.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
