Продвижение выживания и дифференцировка нервных стволовых клеток с фибрином и фактор роста Коктейли после Тяжелая травмы спинного мозга
Summary
Фибриновые матрицы, содержащие факторы роста были использованы, чтобы сохранить привитые нервные стволовые клетки в участках полной перерезки спинного мозга. Привитые клетки полностью заполнил полость поражения и дифференцировались в нескольких нейронных типов клеток, в том числе нейроны, которые простирались аксоны в принимающей спинного мозга на большие расстояния.
Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) могут самообновлению и дифференцировке в нейроны и клетки глии. Пересаживают НСК может заменить потерянные нейронов и глии после травмы спинного мозга (SCI), и могут образовывать функциональные реле повторного подключения сегментов спинного мозга выше и ниже поражения. Предыдущие исследования прививки нервные стволовые клетки были ограничены неполного выживание трансплантата внутри спинного мозга полость поражения. Кроме того, отслеживание выживание трансплантата клеток, дифференциации и расширения процесса не были оптимизированы. Наконец, в предыдущих исследованиях, культивированные NSCs крысы, как правило, сообщалось дифференцироваться в глии, когда прививают на поврежденный спинной мозг, а не нейронов, если судьба не был доведен до определенного типа клеток. Для решения этих проблем, мы разработали новые методы для улучшения выживаемости, интеграции и дифференциации НСК к сайтам даже тяжелой ТСМ. NSCs были недавно выделены из эмбрионального день 14 спинного мозга (E14) от стабильной трансгенных крыс Fischer 344 линии, экспрессирующей зеленый этлюминесцентных белок (GFP) и были встроены в фибринового матрикса, содержащего факторы роста; эта формулировка направлена сохранить трансплантированных клеток в полости поражения и поддерживать жизнеспособность клеток. НСК в коктейле фибрина / фактора роста были имплантированы две недели после грудной уровень-3 (Т3) полных спинного transections мозга, что позволяет избежать пиковых периодов воспаления. Полученные трансплантаты полностью заполнена полость поражения и дифференцировались в обоих нейронов, которые расширенных аксоны в принимающей спинного мозга над удивительно большие расстояния, и глии. Прививки из культивированных человеческих НСК выражающих GFP привели к аналогичным результатам. Таким образом, методы определены для улучшения нейронной прививки стволовых клеток, выживание и анализ естественных условиях выводов в.
Introduction
Травма спинного мозга (ТСМ), часто повреждает не только в белом веществе участки, которые несут сигналы от головного мозга, но и центральный серого вещества, в результате чего сегментарную потерю интернейронов и мотонейронов. Следствием ТСМ является потеря как и моторной функции ниже поражения. К сожалению, взрослый центральной нервной системы (ЦНС) не спонтанно регенерировать, в результате постоянных функционального дефицита 1. Таким образом, реконструкция ранения взрослого спинного мозга и улучшению моторных, сенсорных и вегетативных функций является важной задачей исследования SCI. Нервные стволовые клетки (НСК), прямо изолированы от эмбриона или взрослого ЦНС, убедительные кандидаты клетки, чтобы заменить потерянные нейронов и глии. Более того, эти клетки имеют потенциал, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления аксонов проводимость через поражение сайте 2,3.
На сегодняшний день не было подробное выяснение анатомических, electrophysiological и поведенческие эффекты нейронов формирования реле по трансплантированных НСК после тяжелой ТСМ. Есть несколько причин для этого: во-первых, пересаженные НСК или ЦНС плода ткани выжить плохо, когда привитые в крупные поражения полости. Предыдущие исследования показывают, существенные потери в начале клеток, в результате чего большая пустая кистозные поражения полостей 4,5. В некоторых исследованиях привитые клетки впоследствии разделить и заполнить полость поражения 4,5, но это может произойти с задержкой от нескольких дней до недель, и последующее заполнение поражение сайт не может быть полным или последовательным. Во-вторых, эффективная система отслеживания, которая обеспечивает надежные данные о клеточном выживания, дифференциации / созревания, и результат развития трансплантированных НСК недоставало. Большинство ранних исследований использованы антеградно и ретроградной маркировки проследить аксональные проекции из трансплантации 2,3. Однако, эти методы лишь частично и часто неясно, меченные аксонов проекции, вытекающие из трансплантированных клеток, а также методы трассирующие являются субъективнот к артефактам, вызванных утечкой красителя за имплантированных клеток. Другие группы использовали специфические нейронные маркеры человека маркировать аксональные прогнозы после трансплантации фетальных НСК человека в травму грызунов спинного мозга 5,6. Тем не менее, в этих исследованиях, ксенотрансплантаты не последовательно хорошо выживают. Недавно вирусный доставка гена GFP репортера была использована для обозначения культивированных НСК 7,8. Тем не менее, выражение GFP был часто непоследовательны и может быть вниз регулируется 7. В последнее время использование трансгенных мышей или крыс-доноров, стабильно экспрессирующих репортерный ген GFP, или человеческий плацентарный щелочную фосфатазу, значительно улучшилось отслеживание трансплантированных нервных стволовых клеток / клеток-предшественников в естественных 9,11. В-третьих, некоторые исследования показывают, что в пробирке культивированный НСК крысы, полученные либо из эмбриона или взрослого ЦНС исключительно дифференцироваться в глиальные линий при трансплантации в среде с нетронутыми или ранены взрослого спинного корг 7,12,13, несмотря на то, что эти нервные стволовые клетки способны дифференцироваться в обоих нейронов и глии в пробирке, указывая, что местные условия окружающей среды могут диктовать судьбу стволовых клеток. Кроме того, культивируемые NSCs, особенно те, которые получены из взрослой ЦНС, могут иметь внутренним свойством defaulty дифференцироваться в глиальные линий в естественных условиях 13.
Из-за ограничений, описанных выше, наша группа недавно разработала новый протокол для улучшения эмбриональных отслеживание НСК, выживание, и дифференциация / созревание в тяжелые ранения взрослого спинного мозга. Вкратце, мы начали со стабильным трансгенных Фишер 344 крысы ИНБРЕДНЫЕ линии, выражающей ген-репортер GFP, которая поддерживает выражение GFP после трансплантации в естественных условиях 14. Далее, мы использовали Свежевыделенные НСК из эмбриональных день 14 Fischer 344 спинной мозг, этап развития, который сохраняет потенциал для создания как нейроны и глиальные клетки. Наконец, мы встроилинедавно диссоциированные НСК в фибрин матрицы, содержащей факторов роста 15-17 сохранить клетки и равномерно распределить их в большой полости поражения, с целью поддержать выживание трансплантата клеток, дифференцирование и интегрирование. Прививки были помещены в местах T3 полной перерезки, через две недели после травмы спинного мозга. Эти привитые клетки последовательно заполняется полные перерезки сайтов и дифференцировались в обильных нейронов, которые простирались большое количество аксонов в принимающей спинного мозга на большие расстояния 18. Аналогичные результаты были получены с использованием культивированных трансплантатов стволовых нервных клеток человека к иммуно-дефицитных крыс 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из основных препятствий для трансплантации НСК в поврежденный спинной мозг беден выживание в поражения центра. Любые пробелы или полости в месте повреждения может потенциально снизить или ослабить формирование функциональных нейронных реле между супраспинальных аксонов и раз…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Rat ресурсов и научно-исследовательский центр, Университет Миссури, Колумбия, штат Миссури, для обеспечения GFP крыс; Neuralstem Инк для обеспечения человека нервные стволовые клетки. Эта работа была поддержана Администрацией по делам ветеранов, NIH (NS09881), канадской исследовательской организацией спинного, Крэйг Х. Нильсен Foundation, и Бернард и Энн Spitzer Благотворительный фонд.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
