الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب
Summary
يسمح أسلوب STA-PUT للفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا المنوية على أساس الحجم والكثافة.
Abstract
الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين. حاليا، لا يوجد نظام موثوق زراعة الخلايا مما يسمح لتمايز المنوية في المختبر، وتتطلب معظم الدراسات البيولوجية للخلايا المنوية الحصاد الأنسجة من النماذج الحيوانية مثل الماوس والفئران. لأن الخصية يحتوي على العديد من أنواع الخلايا – على حد سواء غير المنوية (ايديغ، سيرتولي، النخاعي، والخلايا الظهارية) والمنوية (أمهات المني، الخلايا المنوية، طلائع منوية الجولة، التكثيف طلائع منوية والحيوانات المنوية) – دراسات الآليات البيولوجية المعنية في الحيوانات المنوية تتطلب العزلة وإثراء هذه أنواع مختلفة من الخلايا. يسمح أسلوب STA-PUT لفصل السكان غير متجانسة من الخلايا – في هذه الحالة، من الخصيتين – من خلال BSA الانحدار الخطي. أنواع الخلايا الفردية الرواسب مع مختلف سرعة الترسيب وفقا لمحجم ليرة لبنانية، والكسور المخصب لأنواع مختلفة من الخلايا التي يمكن جمعها والاستفادة منها في إجراء المزيد من التحليلات. في حين أن طريقة STA-PUT لا يؤدي إلى كسور نقية للغاية من أنواع الخلايا، على سبيل المثال كما يمكن الحصول مع بعض أساليب الخلية والفرز، وأنها لا توفر عائدات أعلى بكثير من مجموع الخلايا في كل جزء
(~ 1 × 10 8 خلايا / نوع من الخلايا المنوية من السكان بدءا من 7-8 × 10 8 خلايا). يتطلب هذا الأسلوب عالية الغلة الأواني الزجاجية المتخصصة فقط ويمكن القيام بها في أي غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة، مما يجعلها وسيلة مثالية للمختبرات التي لديها محدودية فرص الحصول على المعدات المتخصصة مثل مضان تنشيط فارز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو elutriator.
Introduction
الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين 1. لفترة وجيزة، وقف مثل أمهات المني الموجودة بالقرب من ظهارة نبيب الفجوة المنوية وتفرق في الخلايا المنوية، التي تخضع ثم الانقسامات الانتصافي. بعد الانقسام الاختزالي كاملة، وخلايا فرداني الناتجة عن ذلك، أو طلائع منوية الجولة، الخضوع لتكون النطاف، وهي عملية التمايز التي تنطوي على سفك السيتوبلازم والضغط من النواة. طلائع منوية تتطور تدريجيا السوط والخضوع استطالة والتكثيف من نواة، وإنتاج التمطيط ثم التكثيف طلائع منوية، على التوالي. المنتجات النهائية هي الحيوانات المنوية، والتي تم إصدارها في تجويف أنبوب صغير المنوية ومنه إلى البربخ حيث تنضج أخرى.
لأن عملية تكوين الحيوانات المنوية يعتمد على الظروف الهرمونية والجزيئية الخاصة فيالخصيتين، لم يتم حتى الآن وضع نظام موثوق الثقافة في المختبر لكامل عملية تكوين الحيوانات المنوية 2،3. وقد تم تطوير أساليب لخلق ثقافة "الجرثومية البدائية خلايا تشبه الخلايا" و "الخلايا مثل أرومة النطفة الجولة" فرداني، من الخلايا الجذعية، ولكن هذه الأساليب ليست قادرة على توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا وتفشل في إنتاج الخلايا المنوية في وقت لاحق بعد أنواع 4،5. لحسن الحظ، وأنواع الخلايا المنوية تختلف اختلافا كبيرا في الحجم، والذي يسمح لنظام التعليق وحيدة الخلية التي تم الحصول عليها من الخصيتين كله أن تكون مفصولة مع التدرج السائل. طريقة STA-PUT، تظاهر هنا، يستخدم الانحدار الخطي BSA والترسيب بسيطة لفصل الخلايا المنوية على أساس الحجم والكتلة 6-9.
طريقة STA-PUT ديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب الأكثر استخداما على نطاق واسع لفصل أنواع الخلايا المنوية: نظام مراقبة الأصول الميدانية وتصويل 10-13. جهاز STA-PUT يتطلب قلذ عدة قطع من الأواني الزجاجية المتخصصة تجميعها في غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة. وبالتالي، فمن أقل تكلفة من استخدام فارز الخلية أو elutriator. طريقة STA-PUT ينتج كميات أكبر من الخلايا لكل نوع من الخلايا والخصية مما يمكن الفرز حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في إطار زمني مشابه، على الرغم من نقاء كل السكان الخلية ليست عالية مثل تلك التي حصلت مع نظام مراقبة الأصول الميدانية 11. فرز الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي (المغناطيسية الفرز الخلية تفعيلها، MACS) مؤخرا استخدمت بنجاح لتخصيب أمهات المني من السكان الخلية الخصية مختلطة، لكنه غير مناسب حاليا لفصل الخلايا المنوية أو طلائع منوية بسبب الافتقار إلى المعرفة السطحية المناسبة علامات 14. ميزة إضافية للأسلوب STA-PUT على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو MACS هو القدرة على عزل خلايا قابلة للحياة مناسبة لاحقة لأن الثقافة، وعلى النقيض من معظم بروتوكولات نظام مراقبة الأصول الميدانية، أنها لا تتطلب أي الحمض النووي أو أنواع أخرى من تلطيخ. للدراسات التي تتطلب لغلة الدو من أنواع الخلايا المنوية في ~ 90٪ النقاء، وSTA-PUT هو الأسلوب الأمثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
أولئك الذين يدرسون الحيوانات المنوية الاعتماد على النماذج الحيوانية لعينات الخلايا المنوية، كنظام ثقافة الخلية موثوق بها لا وجود لها حتى الآن طريقة لتوليد كل أنواع الخلايا المنوية 3. على الرغم من أن الخلايا المنوية يتم جمعها بسهولة من الخصيتين كله، النتائج فق…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM055360 إلى SLB وU54HD068157 لRGM. وأيد JMB من التدريب غرانت T32 علم الوراثة في جامعة ولاية بنسلفانيا (GM008216).
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Referências
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
