L'articolo descrive un metodo per la produzione di una matrice acellulare di ratto intestino. La derivazione di ponteggi intestinale è importante per le future applicazioni in ingegneria dei tessuti, biologia delle cellule staminali e test anti-droga.
Ingegneria tissutale riuscito coinvolge la combinazione di scaffold con cellule idonee in vitro o in vivo. Ponteggi possono essere sintetico, di derivazione naturale o derivati da tessuti / organi. Questi ultimi sono ottenuti utilizzando una tecnica chiamata decellularization. Decellularization può comportare una combinazione di metodi enzimatici fisici, chimici, e. L'obiettivo di questa tecnica è quello di rimuovere tutte le tracce cellulari mantenendo la macro e micro-architettura del tessuto originale.
Ingegneria tessuto intestinale ha finora utilizzato ponteggi relativamente semplici che non replicano la complessa architettura del fegato nativo. Il focus di questo lavoro è quello di descrivere una tecnica decellularization efficiente per ratto piccolo intestino. L'isolamento del piccolo intestino in modo da garantire il mantenimento di una connessione vascolare è descritto. La combinazione di soluzioni chimiche ed enzimatiche per rimuovere le cellule whilst preservare l'asse villo-cripta sotto l'aspetto luminale del patibolo è impostato anche fuori. Infine, la valutazione di scaffold prodotti per caratteristiche adeguate è discusso.
L'ingegneria tissutale (TE) offre un'alternativa terapeutica del trapianto di organi, bypassando problemi di immunosoppressione e la carenza di organi. TE ha recentemente avuto applicazioni di successo nella clinica, con sostituzione di organi come la vescica 1, 2 uretra e trachea, sia negli adulti e nei bambini 3,4 5.
Costruzione di un organo tissutale richiede la combinazione di un ponteggio con le opportune cellule. Un ponteggio può essere preparato usando derivazione naturale (ad esempio collagene) e (ad esempio acido poli-L-glicolico; PLGA) materiali sintetici, o essere ottenuta con la decellularization di organi e tessuti nativi. Ponteggi che sono stati utilizzati finora per TE intestinale sono principalmente di due decellularized (piccola sottomucosa intestinale) o sintetica (acido poli-L-glicolico e acido poli-lattico) 6-13. Questi biomateriali sono molto semplici sia in macro e micro-architettura, chepuò non essere l'ideale se intestino tissutale deve essere clinicamente tradotto. Un biomateriale ottimale per l'intestino dovrebbe avere un albero vascolare innata che può essere collegato all'alimentazione sangue dell'ospite, una parete tubolare livelli con proprietà diverse per riflettere gli strati della parete intestinale e un asse villi cripta sul lato luminale per aiutare con ripopolamento da parte delle cellule staminali epiteliali.
Decellularization è una nuova metodologia che produce ponteggi rimuovendo le cellule di organi interi pur mantenendo la loro originale architettura 14. Questo è preferibile scaffold già esistente dal momento che replicano non solo la struttura dell'organo ma anche contengono indicazioni chimiche incorporati nella matrice extracellulare (ECM) che aiuti la proliferazione e la differenziazione cellulare. Nel 2008 un trachea cadavere è stato decellularized 14, seminati con cellule proprie del paziente, e trapiantato a sostituire le principali bronco sinistro in un giovane <sup> 3. Da allora, vari gruppi hanno riportato la produzione di scaffold decellularized per il cuore 15, 16,17 fegato, polmone e 18-20 nelle piccole e grandi animali.
Abbiamo anche adattato la stessa metodologia per produrre un piccolo intestino ponteggio decellularized 21. L'obiettivo del metodo qui descritto è di produrre matrici intestinali decellularized che mantengono le caratteristiche macroscopiche del tessuto originale, come la fornitura di sangue, così come l'architettura microscopica dell'asse villi-cripta nel lume intestinale. Crediamo che questo metodo potrebbe infine essere adottata per altri organi per migliorare l'efficienza di decellularization.
Le fasi più difficili nella creazione di questo esperimento implicano l'incannulamento della SMA e la creazione e il mantenimento della sterilità. Cannulating la SMA nei roditori senza rompersi la parete può essere molto difficile a causa delle dimensioni e della posizione della nave. In alternativa, una sutura può essere posizionato intorno dell'aorta prossimale prima origine SMA, seguita da incannulazione dell'aorta sé distalmente, dirigendo la cannula di plastica nella SMA. Durante decellularization una combinazione di scarsa posizionamento cannula e portate elevate può portare a perdere l'accesso vascolare. La sterilità è una questione importante a causa della quantità di flora batterica presente nell'intestino tenue. Lavaggio con PBS / AA raccolto successivo è molto importante, e qualsiasi segno di materia fecale o detriti deve essere rimosso dal lume. Effettuazione di una porzione del ponteggio in un tubo Falcon con DMEM nell'incubatrice seguente sterilizzazione UV dovrebbe essere un indicatore se la sterilità è stato raggiunto. Nel casodi colonizzazione batterica, i media cambierà il pH con il suo colore girando da rosso a giallo. Per far fronte a ciò, ulteriori cicli UV sono invitati nonché lavaggio con PBS contenente un'alta concentrazione di antibiotico / antimicotico.
Una possibile modifica avere un ponteggio con accesso sia vascolare e venosa sarebbe incannulare la vena cava inferiore (IVC) nonché la SMA. Decellularization dai lati venose e vascolari deve essere eseguita in modo intermittente per tutte e tre le soluzioni. Decellularization continua può scoppiare i capillari facendo pressione positiva su entrambi i lati.
Nel corso degli anni ci sono stati una serie di sforzi intestinale TE utilizzano differenti combinazioni di cellule-scaffold in vitro e in vivo 6,9,12. La maggior parte del lavoro è stato eseguito utilizzando tubolari non tessuto 95% PGA-5% scaffold PLGA rivestiti con collagene di tipo I 6,7,13,22. A seguito di semina con intestinaleunità epiteliali organoide (UO) e un periodo dell'impianto nel omento di topi, formano cisti con il muscolo all'esterno e all'interno epitelio che possono poi essere tubularizzato. Tuttavia, la porosità e la semplicità nella progettazione di questi scaffold non consente per la generazione di grandi pezzi di intestino artificiale in un ambiente in vitro come quello di un bioreattore. Inoltre, la mancanza di una rete vascolare innata che può essere collegato al destinatario limita ulteriormente l'uso di questo scaffold per la traduzione clinica. Oltre agli esperimenti con i ponteggi PGA-PLGA, altri gruppi hanno utilizzato collagene o SIS ponteggi, entrambi i quali non replicano la complessità del tratto intestinale. SIS in particolare è l'unico precedente metodologia pubblicata dell'ingegneria tessuto intestinale ed è stato utilizzato in più di 150 regolazioni mediche, dimostrando la capacità di ponteggi decellularized per fornire stabilità meccanica e promuovere la crescita delle cellule mentre piombozione di nessuna risposta immunogenica. Tuttavia, la mancanza di adeguate macro-e micro-architettura, ha portato a scarsi risultati nel suo 'utilizzazione a fini intestinali TE 9-11,23.
I vantaggi della metodologia decellularization abbiamo descritto includono la conservazione delle caratteristiche microscopiche come il luminal architettura cripta-villo che rappresentano un ambiente appropriato per il ripopolamento dalla intestinale nicchia delle cellule staminali. Sotto l'aspetto macroscopico, la presenza di una rete vascolare gerarchica consentirà allegato al destinatario, consentendo fornitura di sostanze nutritive e ossigeno a tutto strato del TE-intestinale 21. Per di più, la manutenzione dei componenti ECM come glyocosaminoglycans collagene, elastina e ha un ruolo importante non solo per caratteristiche meccaniche, ma anche dirigere la proliferazione e la differenziazione cellulare. Soprattutto, la capacità della metodologia decellularization per essere scalata in grandetessuti r pur mantenendo le stesse caratteristiche è una caratteristica importante per la traduzione clinica di TE.
Lo sviluppo di una matrice intestinale naturale con una rete vascolare permette la creazione di grandi segmenti di intestino artificiale che può essere collegata al sistema host.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano il Wake Forest Institute di Medicina Rigenerativa per il loro aiuto con lo sviluppo di questo protocollo. Noi riconosciamo il sostegno da finanziamenti della carità Great Ormond Street Hospital, la Fondazione Eugenio Litta (Ginevra, Svizzera), il Medical Research Council, il Royal College of Surgeons of England, i bambini Sparks Medical Charity, il Foreign Office britannico per il Regno Unito / USA Stem Cell Collaboration Award e del Fondo di ricerca Mittal. Vorremmo anche ringraziare la Fondazione Royal Society / Wolfson per la concessione di ristrutturazione del laboratorio di ingegneria tissutale ottenuto per il Dipartimento di Chirurgia Pediatrica presso l'Istituto di Salute del Bambino. PDC e SE sono supportati da Carità Great Ormond Street Children del Hospital.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |