Ansikts Transplantationer i<em> Xenopus laevis</em> Embryon
Summary
En teknik för att transplantera "Extreme Anterior Domän" ansiktsvävnaden mellan Xenopus laevis embryon har utvecklats. Vävnad kan flyttas från ett genuttryck bakgrund till en annan, vilket gör studiet av lokala krav för kraniofaciala utveckling och för att signalera interaktioner mellan ansikts regioner.
Abstract
Kraniofaciala missbildningar förekommer hos 1 av varje 700 levande födda, men etiologin sällan känt på grund av begränsad förståelse för kraniofaciala utveckling. För att identifiera var signalvägar och vävnader agerar under mönstring av framkallnings ansiktet, har en "ansiktstransplantation" teknik utvecklats i embryon av grodan Xenopus laevis. En region av presumtiva ansiktsservetter (den "Extreme Anterior Domain" (EAD)) avlägsnas från en givare embryo vid tailbud skede, och transplanteras till en värd embryo av samma scen, från vilken motsvarande region har tagits bort. Detta kan användas för att generera en chimär ansiktet där värd-eller donatorvävnad har en förlust eller vinst av funktion i en gen, och / eller innefattar en härstamning etikett. Efter läkning, är resultatet av utvecklingen övervakas, och indikerar roller signalväg i givaren eller omgivande värdvävnader. Xenopus är en värdefull modell för ansiktet utveckling, som ansikts-regionen är stor och lätt enccessible för mikromanipulering. Många embryon kan analyseras, under en kort tidsperiod eftersom utvecklingen sker snabbt. Fynden i grodan är relevanta för mänsklig utveckling, eftersom kraniofaciala processer verkar bevaras mellan Xenopus och däggdjur.
Introduction
För att förstå mekanismerna bakom kraniofaciala missbildningar 1-2, viktiga vävnader och deras signal bidrag under kraniofaciala utveckling måste identifieras. I grodan Xenopus laevis, en del av ansiktet, inklusive munnen och näsborrar form från "Extreme Anterior Domän" (EAD), där ektoderm och endoderm direkt juxtaposed 3-4. EAD fungerar också som ett signaleringscentrum för att påverka omgivande vävnader, inklusive kranial neural crest, vilket bildar käftarna och andra ansiktsregioner 5. För att identifiera gener som bidrar till EAD-funktion, var en "ansikte transplantation" teknik som utvecklats, där vävnad transplanteras från en donator till en värd embryo, efter avlägsnande av motsvarande värdregionen. Efter transplantationen, vilket resulterar i ansiktet utveckling bedöms. Således är effekterna av förlust av funktion (LOF) eller vinst på funktion (GOF) för en specifik gen i EAD analyseras lokalt, där resten av head och kroppen är sammansatt av vildtyp vävnad. Den ömsesidiga transplantation kan utföras, där vildtyp vävnaden transplanteras in i embryon med global LOF eller GOF i specifika gener. Transplantation har ofta använts i Xenopus och chick Studier 6. Till exempel har Xenopus transplantation riktat homogenetic neural induktion, objektiv och neurala kompetens, och neurallist migration 7-10. Quail-chick chimär ympning har analyserat utvecklingen av den främre neurala plattan, främre neurala ås, neurallist och skallbenen 11-14. Detta är den första transplantationen teknik för studier av kraniofaciala utveckling i Xenopus. Har denna teknik visat en ny roll för Wnt-hämmare Frzb1 och Crescent i regleringen av basalmembranet bildning i den presumtiva munnen 5. Xenopus laevis är en idealisk modell för studier av kraniofaciala utveckling som embryon är stora, utvecklas externt, ennd ansiktet är väl synlig, så att mikromanipulation och avbildning av utveckling. Mekanismerna bakom ansikts utveckling verkar bevaras, vilket tyder på att resultaten av den grodan ge insikt i människans utveckling 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska moment och Begränsningar: EAD ansikte transplantationen är tid och arbeta intensivt. Det kräver övning, stadiga händer, och fingerfärdighet för att fullända. Ansiktet transplantation protokoll bygger på forskarens förmåga att effektivt ta bort och transplantationsvävnad. Om man tar för lång tid att föra in transplantation i värdens ansikte, kommer värd ansikte börjar att dra ihop sig och läka. Tång kan användas för att varsamt expandera ansikts-regionen. Men om betydande sårkontrak…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Radek Sindelka för hans hjälp, och Cas Bresilla för att hjälpa till med grodan djurhållning och embryo förberedelse. Detta arbete har finansierats av NIH via bidrags R01DE021109 till HLS Laura Jacox finansierades av Herschel Smith Graduate Fellowship vid Harvard University och en F30 enskilda stipendium bidrag F30DE022989-01 genom NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Referências
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Biologia do Desenvolvimento. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
