Los trasplantes faciales en<em> Xenopus laevis</em> Los embriones
Summary
Una técnica para el trasplante "Extreme anterior Dominio" tejido facial entre Xenopus laevis embriones se ha desarrollado. Los tejidos pueden moverse de un fondo de la expresión génica en otro, lo que permite el estudio de las necesidades locales para el desarrollo craneofacial y de señalización interacciones entre las regiones faciales.
Abstract
Defectos congénitos craneofaciales presentan en 1 de cada 700 nacidos vivos, pero la etiología rara vez se conoce debido a la limitada comprensión del desarrollo craneofacial. Identificar donde las vías de señalización y tejidos actúan durante modelado de la cara en desarrollo, una técnica de 'trasplante de cara' ha sido desarrollado en embriones de la rana Xenopus laevis. Una región de tejido facial presuntiva (el "extremo anterior de dominio" (EAD)) se retira de un embrión en la etapa de donantes tailbud, y se trasplanta a un embrión de acogida de la misma fase, de la que la región equivalente se ha eliminado. Esto puede ser usado para generar una cara quimérico donde el tejido del huésped o de un donante tiene una pérdida o ganancia de función en un gen, y / o incluye una etiqueta de linaje. Después de la curación, el resultado del desarrollo se controla, y indica funciones de la vía de señalización dentro de la donante o tejidos del huésped circundantes. Xenopus es un modelo valioso para el desarrollo de la cara, como la región facial es grande y fácilmente unccessible de micromanipulación. Muchos embriones se pueden ensayar, durante un período de tiempo corto ya que el desarrollo se produce rápidamente. Los hallazgos en la rana son relevantes para el desarrollo humano, ya que los procesos craneofaciales aparecen conservadas entre Xenopus y mamíferos.
Introduction
Para comprender los mecanismos subyacentes defectos craneofaciales congénitos 1-2, tejidos importantes y sus contribuciones de señalización durante el desarrollo craneofacial debe identificarse. En la rana Xenopus laevis, parte de la cara, incluyendo la boca y nariz de la forma "Extreme Anterior Domain" (EAD), donde ectodermo y endodermo se yuxtaponen directamente 3-4. El EAD también actúa como un centro de señalización para influir en los tejidos circundantes, incluyendo la cresta neural craneal, que forma las mandíbulas y otras regiones faciales 5. Para identificar los genes que contribuyen a la función de EAD, una técnica 'trasplante de cara' fue desarrollado, donde el tejido es trasplantado de un donante en un embrión de acogida, después de la eliminación de la región de host correspondiente. Tras el trasplante, dando como resultado el desarrollo facial se evaluó. Por lo tanto, los efectos de la pérdida de la función (LOF) o ganancia de función (GOF) para un gen específico en el EAD se analizaron localmente, donde el resto de la head y el cuerpo está compuesto de tejido de tipo salvaje. El trasplante de reciprocidad se puede realizar, donde el tejido de tipo salvaje se trasplanta en embriones con LOF global o GOF en genes específicos. El trasplante se ha utilizado con frecuencia en Xenopus y pollo estudia 6. Por ejemplo, el trasplante de Xenopus se ha ocupado de la inducción homogenetic neural, la lente y la competencia de los nervios, y la migración de la cresta neural 7-10. Quail-chick injerto quimérico ha analizado el desarrollo de la placa neural anterior, cresta neural anterior, la cresta neural, y los huesos craneales 11-14. Esta es la primera técnica de trasplante para el estudio del desarrollo craneofacial en Xenopus. Esta técnica ha demostrado un nuevo papel para los inhibidores de Wnt Frzb1 y la Media Luna en la regulación de la formación de la membrana basal en la boca de presunción 5. Xenopus laevis es un modelo ideal para el estudio del desarrollo craneofacial como embriones son grandes, desarrollar externamente, unnd la cara es fácilmente visible, lo que permite la micromanipulación y la imagen del desarrollo. Mecanismos que subyacen el desarrollo facial aparecen conservada, lo que indica que los hallazgos realizados en la rana dar una idea de desarrollo humano 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas y Limitaciones: El procedimiento de trasplante de cara EAD es tiempo y trabajo intensivo. Requiere práctica, manos firmes, y la destreza para perfeccionar. El protocolo de trasplante de cara se basa en la capacidad del investigador para eliminar de manera eficiente y trasplante de tejidos. Si se toma demasiado tiempo para insertar el trasplante de la cara del anfitrión, la cara de acogida comenzará a contraerse y sanar. Fórceps se pueden utilizar para ampliar delicadamente la región facial. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Radek Sindelka por su ayuda, y Cas Bresilla para ayudar con la cría de la rana y la preparación de embriones. Este trabajo fue financiado por el NIH a través de la R01DE021109 subvención para HLS Laura Jacox fue financiado por el Herschel Smith de Becas de Postgrado en la Universidad de Harvard y una subvención F30 beca individual F30DE022989-01 a través del NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Referências
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Biologia do Desenvolvimento. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
