Oppdager Somatiske genetiske forandringer i vevsprøver av Exon Capture og massivt parallelle Sekvense
Summary
Vi beskriver utarbeidelse av strekkode DNA biblioteker og påfølgende hybridisering basert ekson fangst for påvisning av viktige kreftassosierte mutasjoner i kliniske vevsprøver av massivt parallelle "neste generasjon" sekvensering. Målrettet exon sekvense tilbyr fordelene med høy gjennomstrømning, lav kostnad, og dyp-sekvens dekning, noe som gir høy følsomhet for påvisning av lavfrekvente mutasjoner.
Abstract
Arbeidet med å avdekke og etterforske viktige onkogene mutasjoner har vist seg verdifullt å legge til rette for riktig behandling for kreftpasienter. Etableringen av høy gjennomstrømning, har massivt parallelle "neste-generasjons" sekvense hjulpet oppdagelsen av mange slike mutasjoner. For å styrke den kliniske og translasjonell nytte av denne teknologien, må plattformene være høy gjennomstrømning, kostnadseffektiv, og kompatibel med formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vevsprøver som kan gi små mengder forringet eller skadet DNA. Her beskriver vi fremstilling av strekkode og multipleksede DNA-biblioteker, etterfulgt av hybridisering baserte fangst av målrettede eksoner for påvisning av cancerassosierte mutasjoner i ferske og frosne FFPE-tumorer hos massivt parallelle sekvensering. Denne metoden muliggjør identifisering av sekvens mutasjoner, kopiere nummer endringer, og velg strukturelle rearrangements involverer alle målrettede gener. Målrettet ekson sekvense tilbyr than fordeler av høy gjennomstrømning, lav pris, og dype sekvens dekning, dermed overdragelse høy sensitivitet for å oppdage lavfrekvente mutasjoner.
Introduction
Identifiseringen av "driver" tumor genetiske hendelser i viktige onkogener og tumor suppressor gener spiller en viktig rolle i diagnostisering og behandling av mange kreftformer en. Storskala forskningsinnsatsen utnytte massivt parallelle "neste-generasjons" sekvensering har aktivert identifisering av mange slike kreftrelaterte gener i de senere år to. Men disse sekvense plattformer vanligvis krever store mengder DNA isolert fra friske frosne vev, og dermed utgjør en stor begrensning for å karakterisere og analysere DNA mutasjoner fra bevarte vev, for eksempel formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) tumorprøver. Bedre innsats for å effektivt og pålitelig karakteriserer "handlingsrettet" genomisk informasjon fra FFPE tumorprøver vil muliggjøre retrospektiv analyse av tidligere banked prøver og videre oppmuntre individualiserte tilnærminger til kreft ledelse.
Tradisjonelt molekylær diagnostic laboratorier har stolt på tidkrevende, lav gjennomstrømming metoder som Sanger-sekvensering og real-time PCR for DNA mutasjon profilering. Mer nylig har høyere gjennomstrømning metoder benytter multiplex PCR eller massespektrometrisk genotyping blitt utviklet for å undersøke tilbakevendende somatiske mutasjoner i viktige kreftgener 3-5. Disse metoder er imidlertid begrenset ved at bare forutbestemte "hotspot"-mutasjoner analyseres, noe som gjør dem uegnet for detektering av inaktiverende mutasjoner i tumorsuppressorgener. Massivt parallell sekvense tilbyr flere fordeler fremfor disse strategiene inkludert muligheten til å avhøre hele eksoner for både vanlige og sjeldne mutasjoner, evnen til å avsløre flere klasser av genomisk endringer som kopi nummer gevinster og tap, og større følsomhet i heterogene prøver 6, 7 . Hele genomsekvense representerer den mest omfattende tilnærming for mutasjon oppdagelse, selv om det er relativly dyrt og pådrar seg store beregnings krav til dataanalyse og lagring.
For kliniske applikasjoner, hvor bare en liten brøkdel av genomet kan være av klinisk interesse, har to spesielle nyvinninger i sekvensering teknologi vært transformative. Først gjennom hybridisering basert ekson fangst, kan man isolere DNA tilsvarende viktige kreftrelaterte gener for målrettet mutasjon profilering 8,. For det andre, gjennom ligation av molekylære strekkoder (dvs. DNA-sekvenser 6-8 nukleotider i lengde), kan man pool hundrevis av prøver per sekvense løp og fullt ut dra nytte av den stadig økende antall massivt parallelle sekvense instrumenter 10. Når kombinert, disse nyvinningene gjør at svulster å være profilert for lavere kostnader og høyere gjennomstrømning, med mindre beregningskrav 11. Videre, ved å omfordele sekvens dekning til bare de genene mest kritiske til den aktuelle applikasjonen, kan man oppnåddeve større sekvense dybde for høyere følsomhet for lave allel frekvens hendelser.
Her beskriver vi vår IMPACT analysen (Integrated Mutation Profilering av Actionkreft Targets), som benytter ekson fangst på strekkode sekvens bibliotek bassenger ved hybridisering ved hjelp av tilpassede oligonukleotider å fange opp alle protein-kodende eksoner og velg introner av 279 sentrale kreftrelaterte gener (Tabell 1 ). Denne strategien muliggjør identifisering av mutasjoner, indels, kopi nummer endringer, og velg strukturelle rearrangements involverer disse 279 genene. Vår metode er kompatibel med DNA isolert fra både fersk frosset og FFPE vev samt fine nål aspirates og andre cytologiske prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår IMPACT analysen produserer en høy justering rente, høy på målet rente, høy target dekning, og høy sensitivitet for å påvise mutasjoner, indels, og kopiere tall endringer. Vi har vist evnen til vår IMPACT analysen til sekvens DNA fra både fersk frosset og arkivert FFPE prøver av lav DNA-inngang. Ved å utføre målrettet exon sekvensering av nøkkelcancerassosierte gener, kan man oppnå meget dype sekvens dekning for eksoner av disse mest kritiske gener derved å maksimere evnen til å oppdage lavfrekvent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Agnes Viale og MSKCC Genomics Kjerne Laboratory for teknisk assistanse. Denne protokollen ble utviklet med støtte fra Geoffrey Beene Cancer Research Center og Farmer Family Foundation.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
