Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Summary

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Abstract

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Os protocolos atuais para lidar com essas questões incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Contagem de colônias e de proteção gentamicina ensaios apenas avaliar a viabilidade de toda a população bacteriana e são incapazes de determinar a viabilidade bacteriana individual. A microscopia electrónica pode ser usado para determinar a viabilidade das bactérias individuais e fornecer informações sobre a sua localização em células hospedeiras. No entanto, as bactérias freqüentemente exibem uma gama de densidades de elétrons, fazendo com que a avaliação de viabilidade difícil. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras. Estes ensaios foram desenvolvidos originalmente para avaliar a sobrevivência de Neisseria gonorrhoeae em neutrófilos humanos primários, mas deve ser umAPLICÁVEL a qualquer interação célula bactéria-hospedeiro. Estes protocolos combinar corantes fluorescentes à membrana permeável (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-fenilindole [DAPI]), o qual mancha todas as bactérias, com corantes fluorescentes de membrana impermeável (iodeto de propídio e SYTOX verde), que só são acessíveis a bactérias não viáveis. Antes de permeabilização de células eucarióticas, de um anticorpo ou reagente fluorescente é adicionada para identificar bactérias extracelulares. Assim, estes ensaios de discriminar a viabilidade das bactérias aderentes e para dentro de células eucarióticas. Um protocolo é também fornecida para a utilização de corantes de viabilidade, em combinação com anticorpos fluorescentes para os marcadores de células eucarióticas, de forma a determinar a localização subcelular de bactérias individuais. Os corantes bacterianas viabilidade mencionados neste artigo são um complemento e / ou alternativa sensível às técnicas tradicionais de microbiologia para avaliar a viabilidade de bactérias individuais e fornecer informações sobre onde as bactérias sobrevivem em célula hospedeiras.

Introduction

Há uma interação dinâmica e co-evolução entre as bactérias e os anfitriões em que residem. As bactérias têm evoluído organelos aderência, sistemas de secreção, e / ou a capacidade de produzir toxinas que permitem a infecção produtiva de fagocítica hospedeiro e as células não fagocíticas. As bactérias também devem lidar com o reconhecimento e actividade antimicrobiana do sistema imune do hospedeiro. O sistema imune do hospedeiro é constituído por componentes inatos e adaptativos incluindo barreiras físicas e químicas, as células do sistema imunológico, o sistema do complemento, e outros componentes da imunidade humoral. Enquanto muitas bactérias são suscetíveis a morte eo afastamento por parte do anfitrião resposta imune de várias camadas, algumas bactérias patogênicas e oportunistas desenvolveram mecanismos para infectar uma variedade de células hospedeiras e subvertem alívio da resposta imune hospedeiro ^1. Neisseria gonorrhoeae é um exemplo de um patógeno bacteriano que está altamente adaptada para persistir no hospedeiro humano. N. gonorrhoeae prontamente coloniza as superfícies luminais de células epiteliais da mucosa do tracto urogenital, da faringe, da conjuntiva, e recto. Colonização desencadeia o recrutamento abundante de neutrófilos nos locais de mucosas. Os neutrófilos são fagócitos profissionais que possuem uma variedade de processos antimicrobianos para matar microrganismos, no entanto, N. gonorrhoeae é capaz de sobreviver na presença de neutrófilos ^2-5. Compreender como bactérias patogênicas, como N. gonorrhoeae subverter, suprimir, e sequestrar a resposta imune para sobreviver em última análise, em ambientes de host normalmente hostis é crucial para o desenvolvimento de novas terapias para o combate a doenças infecciosas.

Protocolos experimentais muitas vezes utilizados para investigar a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Em ensaios de contagem de colónia, uma população de células infectadas é lisadas (por exemplo, com um detergente para which as bactérias são resistentes) para libertar as bactérias. Os lisados ​​são diluídas e plaqueadas em meio à base de agar, e as unidades formadoras de colónias nos lisados ​​são enumerados para cada ponto de tempo e / ou condição experimental. Esta abordagem relata a viabilidade de toda a população de bactérias, mas não é capaz de diferenciar entre a sobrevivência intracelular e extracelular. Uma variação no ensaio de contagem de colónia, o ensaio de protecção de gentamicina, mede especificamente a sobrevivência bacteriana intracelular, com base na incapacidade do antibiótico gentamicina para atravessar a membrana plasmática eucariótica ^6. No entanto, este ensaio é dependente das bactérias que são susceptíveis à morte por gentamicina (ou outro antibiótico que é semelhante eucariótica membrana impermeabilizante) e a incapacidade de o antibiótico para ter acesso às bactérias internos. Portanto, um ensaio de proteção gentamicina pode não ser eficaz para o exame de todas as espécies bacterianas ou ao examinar a sobrevivência bacteriana em altacélulas pinocytic tais como neutrófilos. Nenhuma destas abordagens revela a localização subcelular ou outro comportamento de bactérias individuais (por exemplo, se as bactérias formam agregados ou microcolônias que se comportam de forma diferente a partir de células bacterianas individuais). Outra abordagem frequentemente usado para examinar a viabilidade das bactérias externas e internas individuais é de secção fina de microscopia electrónica de transmissão (TEM). Esta abordagem é vantajosa na medida em que pode fornecer informação sobre a localização das bactérias nas células do hospedeiro (por exemplo, fagossoma, citoplasma, autophagosome), que pode continuar a ser investigada por microscopia imunoelectrónica com anticorpos acoplados a ouro contra marcadores subcelulares. No entanto, a microscopia eletrônica não é especialmente sensível a avaliação da viabilidade bacteriana. Quando seções embutidos são corados com acetato de uranila, citrato de chumbo, ou outros reagentes de elétron-densas e fotografada por microscopia eletrônica, as bactérias elétron-densas são considerados viáveis ​​e electron-Lucent inviável ^7,8. No entanto, esta hipótese superestima viabilidade bacteriana, uma vez que apenas as bactérias mortas com membranas severamente interrompidas e desprovido de citoplasma aparecem elétron-Lucent. Além disso, algumas espécies bacterianas podem exibir uma gama de densidades de electrões de acordo com a sua fase de crescimento, o que torna difícil determinar a viabilidade.

Como uma alternativa ou em adição a estes métodos amplamente utilizados, aqui podemos fornecer protocolos e racional para a utilização de corantes fluorescentes que indicam a viabilidade bacteriana para avaliar a sobrevivência de bactérias aderidas para e internalizados pelas células hospedeiras. Para identificar as bactérias extracelulares, as células infectadas são primeiro expostas a um reagente fluorescente, tal como uma lectina ou anticorpo de bactérias específicas. As células infectadas são então permeabilizadas e expostos a corantes específicos de DNA que são diferencialmente acessíveis às bactérias com membranas intactas versus degradados, como um substituto para a viabilidade bacteriana. No primeiro protocolo, a membrana permeável SYTO9 corante identifica a população bacteriana total, enquanto iodeto de propídio é acessível apenas para as bactérias que comprometeram membranas e são, portanto, consideradas inviáveis. Iodeto de propídio e SYTO9 têm sido utilizados para avaliar a viabilidade de bactérias em biofilmes, discriminar patogênica de bactérias não patogênicas, e enumerar bactérias viáveis ​​transmitidas pela água ^9-12. No segundo protocolo, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifica bactérias totais, enquanto SYTOX Verde só é acessível à população inviável. Estes pares de corantes de viabilidade pode ser combinada com a imunofluorescência para determinar a localização de cada bactéria em relação a uma proteína de interesse, por exemplo, para definir a localização subcelular bacteriana. A utilização destes testes proporciona uma visão chave nas interacções que resultam em sobrevivência ou morte bacteriana durante a infecção das células hospedeiras. Os protocolos descritos neste artigo foi utilizado para avaliar a viabilidade deN. gonorrhoeae que é anexado ao e dentro de neutrófilos humanos primários, incluindo em diferentes populações de neutrófilos phagosomes ^5,13,14. No entanto, estes protocolos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade das bactérias gram-positivas e gram-negativas em fagócitos profissionais, os fagócitos não profissionais, e protozoários ^15-24.

Protocol

1. Avaliando bacteriana Viabilidade com iodeto de propídio e SYTO9 Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com as bactérias de interesse. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos. Lave as células uma vez gentilmente em 0,1 M de 3 – (N-morfolino) propanossulfónico (MOPS), pH 7,2, contendo MgCl2 1 mM (MOPS / MgCl 2). Incubar as células durante 10 min no…

Representative Results

Os protocolos descritos foram usados ​​para examinar a sobrevivência de N. gonorrhoeae após a exposição ao humano primário neutrófilos 5,26. Os neutrófilos foram infectados com N. gonorrhoeae e processados ​​com o protocolo 1, utilizando o corante de viabilidade SYTO9 verde-fluorescente e o iodeto de propídio vermelho fluorescente (Figura 4A). Os corantes foram adicionados, na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permeabilizar preferencialme…

Discussion

Apresentamos aqui dois protocolos que usam ligação ao DNA e corantes de viabilidade em conjunto com uma lectina fluorescente para identificar bactérias vivas e mortas anexados a e no interior das células humanas. Como ambos os protocolos efetivamente discriminar ao vivo a partir de bactérias mortas, a escolha de qual protocolo usar depende do objetivo do experimento. O primeiro protocolo utiliza iodeto de propídio para detectar bactérias não viáveis ​​e SYTO9 para detectar bactérias intactas. Mostrado na <…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377