El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Summary

El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

Abstract

De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) determina los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido, usando principalmente de MALDI (matriz asistida por láser de desorción / ionización) basado en técnicas analíticas. Se necesitan nuevas matrices de molécula pequeña MSI, que pueden mejorar el análisis de bajo peso molecular (MW) los compuestos. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos mientras que disminuye las señales de fondo MALDI. Además, el uso de instrumentos de ultra-alta resolución, tales como iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas, tiene la capacidad de resolver señales de analito a partir de señales de la matriz, y esto puede superar parcialmente muchos problemas asociados con el fondo procedente de la MALDI matriz. La reducción de las intensidades de los grupos de matriz metaestables por FTICR MS también puede ayudar a superar algunas de las interferencias de la matriz asociados con picos de otros instrumentos. De alta resolucióninstrumentos tales como los espectrómetros de masas FTICR son ventajosas, ya que pueden producir patrones de distribución de muchos compuestos simultáneamente mientras que todavía proporciona confianza en las identificaciones químicos. Ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz MALDI para obtener imágenes de los tejidos. En este trabajo, un protocolo para el uso de DT para MALDI imágenes de lípidos endógenos de las superficies de las secciones de tejidos de mamíferos, por-ion positivo MALDI-MS, en un cuadrupolo híbrido ultra alta resolución ha sido proporcionada instrumento FTICR.

Introduction

De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) es una técnica analítica para la determinación de los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido ^1,2. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) MSI para el análisis de péptidos y proteínas se ha utilizado durante más de una década y ha habido grandes mejoras en los métodos de preparación de muestras, la sensibilidad de detección, resolución espacial, la reproducibilidad y procesamiento de datos ^3,4. Mediante la combinación de información de las secciones teñidas histológicamente y experimentos MSI, patólogos son capaces de correlacionar las distribuciones de compuestos específicos con características interesantes patofisiológicamente ^5.

Los patrones de distribución de pequeñas moléculas, incluyendo fármacos exógenos ^6,7 y sus metabolitos ^8-10 también han sido interrogados por MALDI-MS de formación de imágenes de tejido ^11. Los lípidos son quizás el más estudiado cla-ampliamentess de compuestos con imágenes MALDI, tanto en los MS ^12-17 y MS / MS de ¹⁸ modos. El uso de MALDI MSI para la imagen pequeña molécula ha sido limitada por varios factores: 1) matrices de MALDI son ellos mismos moléculas pequeñas (típicamente m / z <500), que generan señales de iones abundantes. Estas señales abundantes pueden suprimir la ionización de analitos de moléculas pequeñas e interferir con su ^19,20 detección. Recubrimiento libre de disolventes matriz ^21, la sublimación de la matriz ^22, y la matriz de MALDI MS prerrecubierto ^23, entre otros, se han desarrollado para mejorar la MSI de pequeñas moléculas.

Las nuevas matrices que pueden mejorar el análisis de compuestos de bajo MW son de gran interés en la pequeña molécula de MSI. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos con las señales de la matriz disminuido. En el modo de ion positivo, 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y-4-hidroxicinámico α-ciano ácido (CHCA) son las dos matrices MALDI MS comúnmente utilizados para MSI ²⁴ </sup>. La matriz ideal sería formar cristales pequeños, a fin de preservar la localización espacial de los analitos. DHB tiende a formar cristales más grandes, por lo tanto, la aplicación de la matriz usando la sublimación se ha desarrollado para superar parcialmente este problema, y ha permitido el uso de esta matriz para formación de imágenes sensibles de los fosfolípidos de ^22,25. 9-amino-acridina se ha usado para MSI de analitos próticos en el modo de ion positivo ²⁶ y para los nucleótidos y fosfolípidos en el modo de ^26-29-ion negativo. 2-mercaptobenzotiazol se ha encontrado para dar la detección de MALDI eficiente de lípidos ^30, y se ha utilizado para la formación de imágenes de cerebro de ratón gangliósidos ^31. La resolución ultra alta de iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas algo pueden aliviar este problema mediante la resolución de las señales de analito a partir de señales de la matriz ^32. Otra ventaja de la utilización de FTICR-MS es que las intensidades de los grupos de matriz son metaestables reduccióned ^33, lo que también reduce estas interferencias ^27.

El uso de ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido ha sido previamente reportado ^34. En este trabajo actual, se proporciona un protocolo detallado para el uso de DT para el MSI de los lípidos endógenos en las superficies de las secciones de tejido de la lente de la especie bovina, en el modo de ion positivo.

Protocol

1. Seccionar los tejidos Flash congelar las muestras temáticas, una vez cosechados, con nitrógeno líquido, enviarlos en hielo seco (si se requiere el envío), y almacenar a -80 ° C hasta seccionar los tejidos. (Si se utilizan muestras comerciales, asegúrese de que las muestras se prepararon de esta manera.) Cortar los órganos a un tamaño manejable para adaptarse a la diana MALDI. Recorte los partes no deseadas del órgano. Para este estudio se describe aquí, las lentes de ternera fueron deca…

Representative Results

Las muestras de tejido que se seccionan y se montaron deshielo en los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO deben estar intactos, sin rotura visible. Para muchos tejidos, montaje sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO deshielo tisular directa es aceptable. Para algunos tejidos específicos, tales como lente bovina, extensa desgarro del tejido se ve a menudo cuando se usa un montaje deshielo directa (Figura 1a). Prerrecubrimiento del portaobjetos de vidrio de ITO con etanol o ácido …

Discussion

Las consideraciones más importantes para el éxito de MALDI MSI son: 1) la preparación del tejido, 2) la elección de la matriz, y 3) la aplicación de la matriz, y 4) la interpretación de datos y análisis. Cuando la muestra y la matriz se preparan adecuadamente, la adquisición de datos de MS está automatizado. El análisis de los datos de este tipo de experimento es bastante mano de obra intensiva.

La preparación del tejido adecuado es crucial para el éxito de los experimentos de MA…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Rat Liver	Pel-Freez Biologicals	56023-2
Bovine Calf Lens	Pel-Freez Biologicals	57114-2	Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)	Sigma-Aldrich	10608	MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)	Sigma-Aldrich	70990	MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)	Sigma-Aldrich	85707	MALDI Matrix
Reserpine	Sigma-Aldrich	83580
Terfenadine	Sigma-Aldrich	T9652
Formic Acid	Sigma-Aldrich	14265
Ammonium Formate	Sigma-Aldrich	14266
Ammonium Hydroxide	Sigma-Aldrich	320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma-Aldrich	302031
Water	Sigma-Aldrich	39253
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34967
Ethyl Acetate	Sigma-Aldrich	34972
Isopropanol	Sigma-Aldrich	34965
Chloroform	Sigma-Aldrich	366927
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Ethanol	Commercial Alcohols		95%
ES Tuning Mix	Agilent Technologies	G2431A
ITO Coated Glass Slides	Hudson Surface Technology	PSI1207000	Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen	Bic	WOSQP11
Airbrush Sprayer	Iwata	Eclipse HP-CS
ImagePrep	Bruker	249500-LS
MALDI adapter	Bruker	235380