マイクロRNA<em>その場で</em>ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション
Summary
この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。
Abstract
この記事では、マイクロRNAプローブをタグ付けされたジゴキシゲニンを用いたin situハイブリダイゼーションによって、腎臓におけるmiRNAの比色検出のための方法を説明します。もともとExiqon社miRNAプローブ1との幅広い使用にKloostermanらによって開発されたこのプロトコルは、腎臓組織におけるmiRNA解析に固有の課題を克服するように変更されました。これらには、構造同定および残留プローブおよび抗体を除去するのは難しいなどの問題があります。比較的薄いを用い、厚さ5mm、強力なプローブ信号が細胞内に保持しながら、腎臓構造の明確な可視化のために許可された組織切片。加えて、プローブ濃度およびインキュベーション条件は、低いバックグラウンドおよび非特異的シグナルを有するマイクロRNA発現の可視化を容易にするように最適化した。ここで、最適化されたプロトコルは、手順の終わりにスライドを装着を通して初期の組織収集および準備を覆って、記載されている。基本componeこのプロトコルの国税庁は、他の組織および細胞培養モデルに適用するために変更することができる。
Introduction
マイクロRNAは、内因的に産生されている非コードRNA（約22ヌクレオチド長）小さい。これらは、一般に翻訳抑制又はmRNA分解を介してタンパク質発現を抑制するように機能する。 miRNAは、それが可能な1つのmiRNAが複数のターゲットを抑制できるようにすること、不完全な相補性を有するmRNA標的に結合する。
細胞型および構造はmiRNAを表現し理解することは、miRNAの発現の変化が、細胞や組織の表現型に影響を与えるそれを通してのメカニズムを理解することの重要な部分です。そのようなmiRNAの配列決定の方法、定量PCRおよびノーザンブロッティングは、全組織におけるmiRNAの検出のために使用することができるが、このアプローチは、一つは、それらが所定の組織内から来た特定の細胞型を決定することはできません。これらの方法を用いて、分析前に細胞性および構造部品の切開は非常に困難であることができ、十分なアイソレーションを達成するために必要な条件は、文献につながる可能性がRNAの遺伝子発現または劣化terations。 in situハイブリダイゼーションは、組織中のマイクロRNAマイクロRNA位置および発現レベルを可視化するために使用される方法である。この技術は、腎臓などの異質な構造で構成組織では特に貴重である。
マイクロRNAは、腎臓発生の2,3および生理学4において調節的役割を果たしていることが示されている。マイクロRNA発現の変化はまた、線維症5月10日 、糖尿病性腎症7、腎癌11,12、および急性腎障害13などの腎病理に関与することが示されている。我々の研究では、腎臓組織のためのin situハイブリダイゼーションのマイクロRNAの最適化は、健康と病気14の両方におけるmiRNA発現の正確な構造上の位置を決定するための貴重であったことを見出した。管状の異なるマイクロRNAの細胞発現の決定は、TAのためにそれらの調節に重要であるrgetsは細胞機能に依存することができる。疾患状態では、miRNAの発現の変化が機能に影響を与えることができる方法を決定することも重要です。
ここで説明する方法の目標は、 他 Kloostermanによって開発された既存のISHの方法論に基づいて構築することでした。15、他の研究16,17、およびExiqon社1によって提案されたものと、ホルマリン固定腎臓組織のための方法を最適化します。我々が正常に片側尿管閉塞18で腎マイクロRNAのmiR-382発現における明確な地域差を識別するために、このメソッドを使用している。このアプローチは、追加の最適化、ならびに他の組織とともに使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事の目的は、ホルマリン固定腎臓の組織でうまく機能situハイブリダイゼーションにおける miRNAのためのプロトコルを記述することでした。このプロトコルを作業中に染色アーティファクトのいくつかの重要な源が特定されている。これらの点に十分注意し、染色アーティファクトを回避し、成功したISHの実行の可能性を高めることができます。
組織?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国国立衛生研究所HL082798とHL111580を補助金によって支えられている。
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
Referências
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