O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).
Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.
Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas1. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e focos de recombinação são facilmente observadas usando este método. No entanto, o tratamento hipotônico interrompe a arquitetura de cromatina subnuclear, portanto essa técnica não é adequada para análise estrutural de núcleos. Consequentemente, um método melhorado foi projetado para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D)(Figura 1). O método de slides 3D permitiu a detecção da localização nascente do RNA em núcleos porque foi inicialmente otimizado para examinar a expressão genética e os estados de cromatina durante a diferenciação de células germinativas testiculares pela fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH)2,3. Este método 3D também é aplicável à combinação de imunofluorescência, DNA e RNA FISH. Além disso, este método tem auxiliado na descoberta da cromatina sexual pós-amioótica (PMSC), um compartimento silencioso dos cromossomos sexuais encontrados nos espermatozoides pós-meioticos2.
O método de slides 3D foi originalmente otimizado através da combinação de duas etapas essenciais de preparação de slides comumente utilizadas para coloração nuclear: a etapa de fixação projetada para fixar materiais nucleares e a etapa de permeabilização destinada a remover materiais citoplasmáticos a fim de melhorar a acessibilidade de reagentes de coloração, como anticorpos e sondas FISH. Como descrito anteriormente em outrapublicação 3,foi determinado que a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação, a fim de obter resultados ideais com baixo fundo citoplasmático. Neste método de slides 3D, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação subsequente são realizadas diretamente em túbulos seminiferos e são seguidas pela dissociação mecânica de células germinativas com fórceps antes de citospinning em slides. Um método alternativo para RNA FISH de células espermatogênicas foi desenvolvido em outro laboratório4. Neste método, consistente com o método 3D, a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação para obter resultados ideais de RNA FISH.
O protocolo a seguir descreve o método de slides 3D e fornece um exemplo de uma possível aplicação, Cot-1 RNA FISH para a detecção de RNAs de nascente nuclear. O DNA do Cot-1 consiste em elementos repetitivos no genoma. Aqui, uma sonda de DNA Cot-1 é hibridizada para um intron e UTR das transcrições nascentes, detectando assim as regiões transcricionáriamente ativas no núcleo5,6. Slides 3D são versáteis e podem ser aplicados a uma combinação de técnicas de imunofluorescência, DNA e RNA FISH, a fim de obter um exame detalhado das relações espaciais entre a arquitetura da cromatina.
Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos7,8. No en…
The authors have nothing to disclose.
Agradeço a Jeannie T. Lee pela supervisão deste projeto quando eu estava no laboratório Lee e Tyler Broering por editar o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Basil O’Connor Starter Scholar Award da Fundação March of Dimes e do NIH Grant GM098605.
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
Forceps | VWR | 300-050 |
Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
Cytospin 3 | Shandon | |
Coplin jar | Fisher | 08-815 |
Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
Cover glass | Fisher | 12-544-G |
Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |