Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi
Summary
Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.
Abstract
Testis germ hücre farklılaşması sırasında nükleer kromatin yapısı dinamik olarak değişir. Aşağıda, farelerde bulunan testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin düzenini korumak için tasarlanmış bir yöntem açıklanmaktadır; bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntemde, testis tübülleri doğrudan sitoplazmik malzemeyi uzaklaştıran bir permeabilizasyon adımı ve ardından nükleer malzemeleri düzelten bir fiksasyon adımı ile muamele edilir. Tübüller daha sonra ayrışır, hücre süspansiyonu sitospundur ve hücreler slaytlara yapışır. Bu yöntem subnükleer yapıların saptanmasında hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir. 3D slayt yönteminin olası bir uygulamasına örnek olarak, nascent RNA’ları algılamak için bir Cot-1 RNA FISH gösterilir. 3D slayt yöntemi, testis germ hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı, DNA ve RNA arasındaki mekansal ilişkilerin ayrıntılı olarak incelenmesini kolaylaştıracaktır.
Introduction
Testislerde, mikrop hücreleri diploid spermatogonia’dan meiosis yoluyla olgun, haploid spermatozoaya farklılaşır. Bu işlem sırasında mikrop hücrelerinin nükleer kromatin yapısı sürekli ve dinamik olarak yeniden şekillendirilir. Yüzey yayılımları genellikle bireysel spermatojenik hücrelerin sitolojik incelemesi için kullanılır. Yaygın bir yüzey yayılım yöntemi, bireysel spermatojenik hücrelerin yayıldığı ve düzleştirildiği hipotonik tedaviyi kullanmaktadır1. Bu koşullar meiotik kromozomların ayrıntılı analizi için en uygun olanıdır. Sinaptik durum ve rekombinasyon odakları gibi kromozomal özellikler bu yöntem kullanılarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, hipotonik tedavi subnükleer kromatin mimarisini bozar, bu nedenle bu teknik çekirdeklerin yapısal analizi için uygun değildir. Sonuç olarak, testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilmiş bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak adlanmıştır (Şekil 1). 3D slayt yöntemi, başlangıçta RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH)2,3ile testis germ hücre farklılaşması sırasında gen ekspresyasyonu ve kromatin durumlarını incelemek için optimize edildiği için çekirdeklerde nascent RNA lokalizasyonunun tespit edilmesini sağlamıştır. Bu 3D yöntem immünofluoresans, DNA ve RNA FISH kombinasyonu için de geçerlidir. Ek olarak, bu yöntem postmeiotik spermatidlerde bulunan cinsiyet kromozomlarının sessiz bir bölmesi olan postmeiotik cinsiyet kromatinin (PMSC) keşfine yardımcı olmuştur2.
3D slayt yöntemi başlangıçta nükleer boyama için yaygın olarak kullanılan iki temel slayt hazırlama adımının kombinasyonu ile optimize edilmiştir: nükleer malzemeleri düzeltmek için tasarlanmış sabitleme adımı ve antikorlar ve FISH probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için sitoplazmik malzemelerin çıkarılması amaçlanan permeabilizasyon adımı. Daha önce başka bir yayında açıklandığı gibi3, düşük sitoplazmik arka plan ile en uygun sonuçları elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerektiği belirlenmiştir. Bu 3D slayt yönteminde, permeabilizasyon adımı ve sonraki sabitleme adımı doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir ve slaytlara sitospinningden önce mikrop hücrelerinin tokalarla mekanik ayrışması ile takip edilir. Spermatojenik hücrelerin RNA BALIK için alternatif bir yöntem başka bir laboratuvarda geliştirilmiştir4. Bu yöntemde, 3D yöntemiyle tutarlı olarak, RNA FISH’in en iyi sonuçlarını elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerekir.
Aşağıdaki protokol 3D slayt yöntemini açıklar ve nükleer nascent RNA’ların tespiti için olası bir uygulama olan Cot-1 RNA FISH’e bir örnek sağlar. Karyola-1 DNA’sı genomdaki tekrarlayan elementlerden oluşur. Burada, bir Cot-1 DNA probu, nascent transkriptlerinin bir intron ve UTR’sine melezlenmiştir, böylece çekirdek5,6’dakitranskripsiyonal olarak aktif bölgeleri tespit eder. Kromatin mimarisi arasındaki mekansal ilişkilerin detaylı incelenmesini sağlamak için 3D slaytlar çok yönlüdür ve immünofluoresans, DNA ve RNA FISH tekniklerinin bir kombinasyonuna uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D slayt hazırlamada, permeabilizasyon adımı sabitleme adımından önce gelir. Bu adımlar doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir, böylece üç boyutlu kromatin yapısı korunur. RNA/DNA FISH için kromatin yapısını korumak için alternatif bir seçenek, permeabilizasyon adımını ve fiksasyon adımını aynı anda gerçekleştirmektir. Bu alternatif teknik keseli mikrop hücrelerinde ve fare preimplantasyon embriyolarında7,8. Ancak, sabitleme adımı permeabilizasyon adımından…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeannie T. Lee’ye lee laboratuvarındayken bu projenin denetimi için teşekkür ederim ve Tyler Broering de taslağı düzenlediği için. Bu çalışma, Dimes Vakfı’nın Yürüyüşü’nden Basil O’Connor Starter Scholar Ödülü ve NIH Grant GM098605 tarafından desteklendi.
Materials
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
| Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Forceps | VWR | 300-050 |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
| Cytospin 3 | Shandon | |
| Coplin jar | Fisher | 08-815 |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
Referências
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
