Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Summary

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Abstract

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici. Per modellare i gliomi maligni di grado III e IV dell’OMS nei test di trapianto, le cellule tumorali umane vengono xenografate in un sito ortotopico, il cervello, di topi immunocompromessi. A differenza degli xenoinnesti secondari che utilizzano cellule tumorali coltivate, le cellule glioma umane vengono dissociate dagli esemplari resected e trapiantate senza passaggio preventivo nella coltura tissutale per generare xenografti primari. La procedura in questo rapporto descrive in dettaglio la preparazione del campione tumorale, il trapianto intracraniale in topi immunocomprosi compromessi, il monitoraggio per l’innesto tumorale e la raccolta del tumore per il successivo passaggio negli animali riceventi o l’analisi. La preparazione delle cellule tumorali richiede 2 ore e la procedura chirurgica richiede 20 min / animale.

Introduction

I gliomi maligni sono tumori gliali primari del sistema nervoso centrale che si verificano nel cervello e occasionalmente nel midollo spinale. I gliomi sono classificati dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) in base alla somiglianza istologica con astrociti, oligodendrociti o cellule ependimali e quindi classificati numericamente (da I a IV) per caratteristiche patologiche di malignità. I sottotipi istologici più comuni sono astrocitomi, oligodendrogliomi e oligoastrocitomi misti. I gliomi maligni che comprendono i gradi da II a IV dell’OMS sono caratterizzati da crescita invasiva e recalcitranza alle terapie attuali. Ogni anno negli Stati Uniti, a circa 15.750 individui viene diagnosticato un glioma maligno e si stima che 12.740 pazienti soccombano a questa malattia. Queste statistiche evidenziano la natura particolarmente letale dei gliomi maligni e l’importante necessità di una maggiore efficacia terapeutica.

I modelli di cancro sono essenziali per studiare la biologia e le terapie tumorali. Le linee cellulari tumorali umane rappresentano un primo passo importante per le manipolazioni in vitro e gli studi di xenoin vivo (xenografti secondari)¹. Tuttavia, le colture standard di cellule tumorali subiscono una trasformazione fenotipico e genotipico^2-4 che potrebbe non essere ripristinata negli xenoinnesti^{secondari 5}. Inoltre, alterazioni genetiche come mutazioni dell’isocitrato deidrogenasi(IDH)⁶, popolazioni distinte di cellule staminali^{7 e} dipendenza dalle principali vie di segnalazione^{8 possono} essere perse nelle colture delle cellule tumorali. I profili genomici possono essere mantenuti in misura migliore nella cultura della sfera tumorale, anche se non riescono ancora a rispecchiare completamente il genotipo dei tumori^{primari 2,3}. Il trapianto ortotopico diretto nega le influenze della coltura in vitro, fornisce un microambiente adeguato e preserva l’integrità delle cellule che iniziano il tumore^9,10. Pertanto, gli xenoinnesti primari rappresentano un modello preclinico potente e pertinente per testare rigorosamente agenti mirati per aiutare nella progettazione razionale dei futuri studi^{clinici 5,11,12}.

Protocol

1. Preparazione della sospensione delle cellule tumorali Nota: Sono necessarie adeguate approvazioni istituzionali per l’uso di materiale paziente e animali per stabilire e mantenere gli xenografti di glioma ortotopici primari. Al Vanderbilt University Medical Center, il materiale tumorale reinsediato che è superiore a quello richiesto per scopi diagnostici viene raccolto con il consenso del paziente per un deposito di tessuti di ricerca. I campioni sono etichettati con un num…

Representative Results

Le cellule di glioma dissociate vengono trapiantate direttamente nel cervello di topi immunocompromessi per ottenere linee primarie di xenograft ortotopico. Ad ogni campione tumorale viene assegnato un numero randomizzato prima del trapianto, come parte del processo di deidentificazione per rimuovere le informazioni sanitarie protette. A tale scopo utilizziamo un numero di database REDcap a 5 cifre. La figura 1 illustra il processo e la nomenclatura per stabilire una linea di xenograft da un glioblastoma…

Discussion

Linee cellulari coltivate, xenografti e topi geneticamente modificati sono i metodi più comuni per modellare i gliomi e ci sono benefici e limitazioni distinti per ogni sistema^{modello 3,13,14}. I benefici rilevanti degli xenografti di glioma ortotopico primario includono la crescita infiltrativa che caratterizza i gliomi diffusi e la ritenzione di alterazioni genetiche e importanti meccanismi di segnalazione che possono essere estremamente difficili da mantenere nelle cellule di glioma coltivate. Ad esempio, <…

Materials

Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400

Material	Company	Catalogue Number	Comments
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501