Bağışıklık Sağlam İnsan MUC1 Transgenik Farelerde İnvaziv Geçici Hücre Mesane Karsinomu indüksiyon: immünoterapi Kalkınma İçin Bir Model
Summary
Bir N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin bağımlı mesane kanseri modelinde insan müsin 1 (MUC1), test amacıyla MUC1 yönlendirilmiş immünoterapi için transgenik farenin olarak geliştirilmiştir. Bir MUC1 hedefli bir peptid aşının sonra, MUC1 bir sitotoksik T-lenfosit yanıt sitokin seviyeleri ve T-hücresi spesifik aktivitesi ölçülerek teyit edilmiştir.
Abstract
Invaziv mesane kanseri bir klinik öncesi modeli insan müsin 1 (MUC1) immünoterapi ve / veya sitotoksik kemoterapi değerlendirmek amacıyla transgenik (MUC1.Tg) farelerde geliştirilmiştir. Mesane kanseri, C57BL / 6 fareleri (MUC1.Tg ve yabani tip) 3.0 mg / gün dozunda kanserojen N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin (OH-BBN) ile oral olarak tedavi edildi, 5 gün / haftada teşvik etmek için 12 hafta boyunca. Tümör gelişimi sırasında sitokin profili üzerinde, OH-BBN etkilerini değerlendirmek için, tam kan submandibuler tedavi öncesinde kanamaları ve her dört haftada ile toplanmıştır. Buna ek olarak, MUC1 hedefli bir peptid, aşı ve plasebo sekiz hafta boyunca haftalık fareler gruplara uygulandı. Tümör gelişimi ve aşağıdaki aşılama sırasında serum sitokin Multiplex florometrik microbead immunoanalyses yapıldı. Çıkışta, interferon gamma (IFN-γ) / MUC1 spesifik T-hücresi bağışıklık tepkisi ve tümör Çeşidi histopatolojik değerlendirme için interlökin-4 (IL-4) ELISPOT analizive sınıf yapıldı. Sonuçlar göstermiştir ki: (1) MUC1.Tg ve vahşi hem tip farelerde mesane kanseri insidansı% 67 idi, (2) 2:1 oranında geliştirilen geçiş hücreli karsinom (TCC) skuamöz hücreli karsinom (SCC) ile karşılaştırıldığında , (3), inflamatuvar sitokinlerin tümör gelişimi sırasında zamanla arttığı ve (4) peptid aşılama, Th1-polarize sitokin profili ve bir MUC1 spesifik T-hücresi tepkisi indükler. MUC1.Tg farenin tüm tümörlerde MUC1 ifadesi için pozitiftir ve MUC1.Tg ve vahşi tip farelerde tüm tümörlerin yaklaşık yarısı invaziv. Sonuç olarak, farmakolog, immünologlar, patologlar ve moleküler biyologların çabalarının koordinasyonu ile bir ekip yaklaşımı kullanarak, biz hMUC1 ifade mesane kanseri bağışıklık sağlam transgenik fare modeli geliştirdik.
Introduction
Mesane kanseri kanser dördüncü en sık görülen ve Amerikan erkeklerde kanser ölümlerinin sekizinci önde gelen nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde, mesane kanserinden tahmini 72.500 yeni olgu ve 15.000 ölüm 2013 1 kombine erkek ve kadınlar arasında bekleniyor. Mesane kanseri insidansı kadınlara göre yaklaşık üç kat erkeklerde yüksek olduğunu. Vakaların% 90'ından için Amerika Birleşik Devletleri'nde, geçiş hücreli karsinom (TTK) hesap, skuamöz hücreli karsinom (SCC)% 2'den az 2 oranı varken. Papiller TTK için genel nispi 5-yıllık sağkalım oranı SCC 2 için 30.9% ile karşılaştırıldığında% 91.5 olduğunu. Noninvaziv papiller TCCS bile hastaların% 50 daha tedavi daha fazla kas invaziv hastalığa 3,4 ilerleyen bu hastaların% 30 kadar ile, 5 yıl içinde nüks yaşayacaksınız ile, tanı sırasında vakaların yaklaşık% 75 için hesap da . Kas olmayan inv için tipik bir tedavi rejimleriAsive hastalığı intravezikal kemoterapi takiben transüretral rezeksiyon (TUR) içerir. Yüksek dereceli Ta veya T1 tümörlü hastalarda, tekrar TUR kemoterapi 3,4 öncesinde yapılabilir. Düşük dereceli Ta nüks veya yüksek dereceli Ta ya da T1 lezyonu olan hastalar için, TUR Calmette-Guerin (BCG), 3,4 kullanılabilir Bacillus şeklinde kemoterapi veya immünoterapi izledi. İntravezikal BCG nüks 5 zamana göre intravezikal mitomisin C üstün olduğu gösterilmiştir. T2 kas invaziv hastalık için, neoadjuvan kemoterapi olan veya olmayan radikal sistektomi tedavi 3 için önerilen bir derstir. SCC olan hastalarda, sistektomi en etkili tedavi 6 gibi görünmektedir. En iyi tedaviler mevcuttur rağmen nüks çok yüksek oranda göz önüne alındığında, mesane kanseri için yeni, daha etkili tedaviler için ihtiyaç açıkça vardır.
Bladd için yeni immünoterapiler genişletilmesier kanseri hastalıksız sağkalım uzatmak için söz tutabilir olası bir yaklaşımdır. Tarihsel olarak, BCG mesane kanseri için tek etkili immünoterapi olmuştur. Tesir mekanizması artan interlökin-2 düzeyleri (IL-2) ve interferon gama (IFN-γ) 4 ile bir T-yardımcı 1 (Th1) tipi immün cevabın non-spesifik indüksiyonu dahil olduğu düşünülmektedir. Hücresel veya Th1 bağışıklık, hümoral veya Th2 olarak kanser immünoterapisi için kritik olan, bağışıklık sistemi büyüme faktörü reseptörleri 7 karşı antikor hariç olmak üzere, katı tümörler karşı etkili olduğu gösterilmiştir olmamıştı. BCG monoterapi yararları geliştirmek için bir girişim, IFN-α 2B/BCG kombinasyonu immünoterapi kesin sonuçları 8 ile bir faz II klinik çalışmada değerlendirilmiştir. Mesane kanseri immünoterapisi için alternatif bir yaklaşım 7 kanser immünoterapisi daha özel yapmıştır belirlenmesini arasında tümör ilişkili antijenler (TAAS), hedef olabilir, </s> kadar.
Böyle bir TAA, mesane, göğüs, akciğer, ve pankreas kanseri 9,10 gibi birçok epitelyal hücre kanserleri aşırı eksprese bir hücre yüzeyi glikoproteini musin 1 (MUC1) 'dir. MUC1 ifadesi ve değiştirilmesi de önemli ölçüde kanser sırasında değiştirildiği, öyle ki underglycosylation peptid çekirdeği üzerine birbiri ardına dizilmiş tekrar bölgesinin değişken sayıda (VNTR) olarak bilinen amino asit dizileri arasında antijenik ortaya koyar. MUC1 kendi kendine moleküldür da, bu immünodominant VNTR bölgelerde normalde Çok kapsamlı glikozilasyon maruz değildir ve bu nedenle yabancı 11,12 olarak bağışıklık sistemi tarafından görülür. Özellikle MUC1 epitopları tanır sitotoksik T lenfositleri (CTL 'ler) bir MUC1 için potansiyel bir hedef alma, meme kanseri olan hastalarda 13, hem de miyelom hastaları 14,15 kan ve kemik iliği, tümör-lenf düğümlerinden izole edilmiştir hücresel bağışıklık tepkisi. Underglycosylate bir immünodominant VNTR dizileriMUC1 D formunda 16-19 tümör hücrelerinin imha sonuçlanan CTL 'ler tarafından tanınır. Kanserli MUC1 özgü hücresel ve / veya humoral bağışıklık yanıtları, ancak, tümörler ortadan kaldırmak için yeterince güçlü değildir. MUC1 için mevcut zayıf bağışıklık yanıtı artırmak için, sentetik immünodominant peptidler klinik yarar 18,20 olması kadar güçlü bir CTL yanıt oluşturmak için aşılama yoluyla sokulabilir. Bir MUC1 lipozomal aşı halen akciğer kanseri hastalarında 21,22 hayatta kalma oranları MUC1-pozitif tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip CTL'lerin oluşturmak ve bir Th1 sitokin tepkisi polarize 23,24 üretmek için gösterilmiştir. MUC1 ifade 9,11,25 bir yüksek düzeyde, mesane kanseri MUC1-yönelik immünoterapi 26,27 test etmek için mantıklı bir adaydır. Ayrıca, MUC1 kanser 28, TTK MUC1 ifade önemli evresi ve derecesi ile ilişkili mesane bir prognostik faktör olarak potansiyele sahip ve metastatik TCCMUC1 29 ifade etmeye devam ettiği gösterilmiştir.
Mesane kanseri MUC1 yönlendirilmiş immünoterapi potansiyel kullanımını değerlendirmek amacıyla, bir bağışıklık bozulmamış insan MUC1 (hMUC1)-ifade C57BL / 6 arka plan 30 mesane kanseri congenic transgenik (MUC1.Tg) fare modeli geliştirilmiştir. İnsan MUC1 30,31 insanlarda gözlenen ile tutarlı bir desen doku ekspresyonu ile sonuçlanan, kendi promotörünün kontrolü altında bir kendi kendine protein olarak ifade edilir. Fareler daha sonra, bilinen mesane kanserojen N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin (OH-BBN) 32 ve sonuçta ortaya çıkan tümörlerin hMUC1 ekspresyonu ile tümör tipi ve derecesi açısından değerlendirildi ile indüklenmiştir. Tümör gelişimi sırasında Th1/Th2 sitokin düzeyleri üzerindeki kanserojen etkisini değerlendirmek için serum örnekleri multipleks analiz için periyodik olarak toplanmıştır. Fareler daha sonra, bir MUC1 hedefli bir peptid aşı ile muamele edilmiş ve sitokin ve bağışıklık tepkileri değerlendirmesine edildimultipleks florometrik microbead immunoassay ve ELISPOT tarafından ted.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insan MUC1.Tg farelerde invaziv geçiş ve skuamöz hücreli mesane kanserinin başarılı indüksiyon immünoterapi gelişimi için klinik öncesi model sunuyor. Immünoterapötik çalışmalar zaman yanı sıra immünoterapi için bağışıklık yanıtı üzerinde tümör ilerlemesi için inflamatuvar yanıt değerlendirmek için bir spontan, bağışıklık sağlam modelinin kullanılmasını gerektirir. Kendiliğinden bir tümör geliştirme modelinde, tümör mikro bozulmadan kalır ve tümörlerin tedavi antitüm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar fareler üreme için UC Davis Fare Biyoloji Anabilim Dalı teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Merck KGaA, Darmstadt, Almanya bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
Referências
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
