In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

Summary

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

Abstract

Há uma necessidade científica emergente para ferramentas confiáveis ​​para monitorar transporte de proteínas de membrana. Apresenta-se um método que conduz à reconstituição das bombas de efluxo na bactéria gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, em um ambiente biomimética que permite uma investigação precisas da sua actividade de transporte. Três pré-requisitos são cumpridos: compartimentação em um ambiente lipídico, o uso de um índice relevante para o transporte ea geração de um gradiente de prótons. O transportador de proteína de membrana é reconstituído em lipossomas, juntamente com bacteriorodopsina, uma bomba de protões activado pela luz que gera um gradiente de protões, que é robusta, assim como reversível e ajustável. A actividade da proteína é deduzida a partir das variações de pH que ocorrem no interior do lipossoma, usando pyranin, uma sonda fluorescente dependente de pH. Descreve-se um procedimento passo-a-passo em que a purificação da proteína da membrana, a formação de lipossomas, a reconstituição da proteína, e um transportenálise são abordados. Apesar de terem sido concebidos especificamente para um transportador de RND, os métodos descritos poderiam ser adaptados para utilização com qualquer outro transportador de proteína de membrana energizados por um gradiente de protões.

Introduction

Proteínas de membrana integrais representar até 30% dos genes codificados em genomas eucarióticos. Eles compartilham um papel central, como a manutenção de portão (receptores), transporte de nutrientes, íons ou compostos nocivos (transportadores) ou a manutenção da permeabilidade da membrana através de camadas duplas (canais) entre todas as células vivas ^1. As bombas de efluxo tem um papel central na resistência contra a terapia antibiótica ^2. Em bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, que é protegida por uma membrana externa, transportadores de efluxo são organizadas como sistemas de tripartidos onde MexB, a bomba de efluxo localizadas na membrana interna, trabalha em conjunto com mexa, uma proteína periplasmática, e, uma OprM canal de membrana externa. A proteína de membrana interna citoplasmática funciona como uma bomba dependente de energia com uma ampla especificidade de substrato. A proteína da membrana externa actua como uma porina enquanto que o terceiro é localizado no espaço periplasmático e é pensado para estabilizar o complexo inteiro <sup> 3. A seguir, vamos nos concentrar no projeto de um ensaio funcional para a montagem Mexa MexB.

A informação estrutural acumulou ao longo dos últimos cinco anos, graças à determinação de raios-X do AcrB proteína homóloga de Escherichia coli ^4-7. Embora seja claramente importante par dessa informação com dados dinâmicos e cinéticos, a concepção de um ensaio funcional para este transportador é um verdadeiro desafio ^8. Com efeito, as proteínas da membrana deve ser mantida em um ambiente membranoso e um compartimento fechado deve ser mantida durante um transporte vectorial de substrato a ser alcançado.

Reconstituição de proteínas de membrana em proteolipossomos foi amplamente apresentados e analisados ​​(ver Rigaud e Levy ^9). Tais protocolos de permitir a monitorização da actividade de proteínas de membrana, por exemplo, seguindo os substratos através da membrana do lipossoma. Neste caso, surgem limitações do umDisponibilidade de substratos tituláveis ​​(fluorescente, radioactivo, etc.) e do facto de que, muitas vezes, estes substratos são hidrofóbicos e têm uma tendência para atravessar as membranas, independentemente da presença do transportador. Como alternativa, pode-se seguir as variações espectroscópicos de um corante relatando sensível a alterações químicas que ocorrem como consequência do transporte. Como afirmado acima, os prótons energizar o transporte via MexB. Assim, uma opção relevante é monitorar as variações espectroscópicas de um corante relato sensível ao pH para acompanhar variações de pH, devido ao transporte de substrato-driven próton. A escolha de um corante fluorescente evita quaisquer efeitos artefatuais devido à natureza hidrofóbica do substrato.

Uma dificuldade adicional é a geração de um gradiente de protões. Vários protocolos podem ser encontrados na literatura. Entre eles, o uso da técnica de valinomicina é generalizado, mas mostrámos que é entediante para executar ^10-11. Além disso, énão reprodutível e não é reversível. Nós têm recorrido ao uso de bacteriorodopsina (BR), uma bomba de protões activado pela luz de Halobacter Salinarium, um obrigatório archaeon halofílica Gram-negativo aeróbico marinha. Esta proteína é coreconstituted em lipossomas com MexB e, após a iluminação, BR bombas de protões no interior dos lipossomas e, portanto, cria o ΔpH (ácida para dentro) necessária para a proteína de transporte do substrato ^12-13.

Protocol

1. Produção e purificação de proteínas Mexa, MexB de Pseudomonas aeruginosa Transforme os plasmídeos contendo os genes Mexa e MexB em um E. coli estirpe de produção (por exemplo, C43 DE3). Placa em LB Agar suplementado com o antibiótico apropriado. Escolha uma única colônia para inocular um pré-cultivo O / N. Na manhã seguinte, inocula a pré-cultura em 1 L de LB e crescer a 37 ° C, sob agitação (240 rpm). Uma vez que as células tenham atingido a fase exponencial (DO600 = 0,6-0,8) induzir com IPTG a 1 mM. Realizar a indução por 2-3 horas a 30 ° C, sob agitação. Células de centrifugação (9000 xg durante 20 minutos) e ressuspender em 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Disrupt células usando uma prensa francesa (10.000 psi, 4 pass). Descarte as células intactas e corpos de inclusão por centrifugação a 9000 xg por 20 min. Membranas de pellets 1 hora a 100.000 x g e resuspend cada pellet em 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. Determinar a concentração de proteína total da membrana utilizando o ensaio colorimétrico de BCA e solubilizar as membranas de O / N com 2% de maltósido de dodecilo (DDM) em um volume final determinada de modo que o detergente: proteína é de 1:1,5 (w / w). Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 h para descartar o material não solubilizado e agregados. Incubar o sobrenadante, durante 2 horas a 4 ° C com uma resina de níquel (mexa purificação) ou uma resina de cobalto (MexB purificação) equilibrada com bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Despeje a resina em uma coluna vazia. Recolher o fluir. Lava-se a resina com 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, em seguida, com 25 ml de bis-Tris 10 mM, pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Eluir o protein com 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Concentra-se a proteína com um dispositivo de ultrafiltração até 3 ml e carga sobre uma coluna de dessalinização, equilibrada com um tampão livre de imidazol. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga proteínas solubilizadas (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Em seguida, concentra-se a proteína novamente até 0,3 ml. Bacteriorodopsina de Halobacter Salinarium Cultivar células Salinarium Halobacter sob iluminação a 37 ° C durante 10 dias num meio de crescimento líquido contendo NaCl 4 M, MgSO4 a 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levedura 5 g / L, e peptona 5 g / L. Disrupt células por diálise contra água deionizada. Purifica-se a membrana de púrpura de 30-40% (w / v) gradiente de sacarose (100.000 xg durante 17 horas). Solubiliza-se a suspensão de membrana com 2% octylglucOside durante 24 horas a 37 ° C (volume para a solubilização, a fim de voltar a suspender a membrana a um detergente 2:1 (w / w): proteína). Estimar a concentração de BR solubilizado usando ε (570 nm) = 54.000 M-1 cm-1. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga a BR solubilizado (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Nota: As membranas nativas são naturalmente enriquecida em BR por isso não purificação adicional é necessária. 2. Preparação de proteolipossomas A formação de lipossomas: Coloque 400 ul de DOPC dissolvido em clorofórmio (25 mg / ml) em um copo de vidro e adicionar 1,5 mg de colesterol armazenado como um pó. Seca-se-lhes imediatamente antes da manipulação sob uma corrente de azoto ou de vácuo durante pelo menos uma hora numa proveta de vidro. O DOPC: proporção molar de colesterol é de 3,3:1. Depois de terem secado, hidratar os lípidos com 1 ml de HEPES 25 mM, pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM de piranina. A suspensão deve aparecer turvação nesta fase. Aquece-se a solução durante 10 min a 37 ° C. Sonicar durante 10 min a 40 W com 30 seg de pulso, 30 sec ciclos de pausa à TA. A suspensão deve aparecer clara nesta fase. Para obter uma população de lipossomas monodispersas, realizar dois ciclos de extrusão e para cada ciclo, passar a suspensão de lipossomas através do filtro, pelo menos, 11x. Para o primeiro ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 200 nm e para o segundo ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 100 nm. Medições de dispersão de luz dinâmica pode ser realizada nesta etapa para verificar a homogeneidade da suspensão. Incorporação de proteínas Princípio: proteínas de membrana pode ser reconstituída em lipossomas, graças ao efeito solubilizante de detergentes. Lipossomas detergente solubilizou-se a incubação com a proteína de membrana solubilizada em detergente e a formação do proteoliposomes é desencadeada por uma rápida eliminação do detergente com grânulos de poliestireno 9. Adicionar 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) e incubar O / N a 4 ° C (a temperatura de solubilização pode ser adaptado para a proteína a ser estudado). Adicionar a proteína solubilizada em detergente (BR, MexB e mexa) para os lipossomas dissolvidos, e incubar 15 min a 4 ° C. Adicionar as proteínas para a suspensão de lipossomas solubilizado nas seguintes proporções (w / w): lípidos / MexB = 20, MexB / mexa = 2,5, e lípidos / BR = 30. Adicionar pérolas de poliestireno em um 30:1 grânulos: proporção de detergente (w / w, considerando o peso total do detergente, inclusive detergente adicionado com as proteínas purificadas) e incubar 5 h, no escuro (por causa da BR) à TA sob suave agitação. Antes deste processo, activar as BioBeads com metanol e etanol e incubação extensivamente lava-se com água. Purifica-se a proteína proteolipossomos e substratos livres utilizando um PD-10coluna de dessalinização, equilibrada com HEPES 25 mM, pH 7, K 2 SO 4 100 mM e MgCl 2 a 2 mM. Armazenar os proteolipossomas a 18 ° C no escuro até 2-3 semanas. Avaliação da eficácia de reconstituição em gradiente de sacarose. Para verificar que tanto o MexB ea BR foram reconstituídos em lipossomos, purificar a suspensão proteolipossomos em um gradiente de sacarose descontínua. Suavemente resolver os proteolipossomas em um gradiente de cinco camadas de sacarose (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). Ultracentrifuge para 17 horas a 100.000 xg (com aceleração mínima e taxas de desaceleração). Recolher cuidadosamente as várias fracções do gradiente (especialmente as interfaces entre cada camada de sacarose), e analisadas em SDS-PAGE (10%) por meio da coloração com Coomassie ou transferência de Western. Proteínas agregadas são encontrados no fundo do tubo, enquanto que, as proteínas de detergente solubilizado nonincorporated são encontrados na parte superior dao tubo. Proteolipossomos e lipossomas são encontrados nas interfaces de sacarose que correspondem à sua densidade intrínseca. Lipossomas vazios são recuperados mais acima no gradiente do que os proteolipossomos. 3. A medição de fluorescência Efectuar as medições de fluorescência a 25,0 ° C por meio de um espectrofluorómetro permitindo medições de duplo comprimento de onda (luz de Xe, 150 W). Períodos de iluminação alternativa (para ativar a BR com comprimentos de onda de excitação / emissão de 550 nm / 550 nm) e medições de fluorescência com comprimentos de onda de excitação / emissão de 455 nm / 509 nm por 2 segundos para medir a fluorescência piranina. Defina as larguras de banda de excitação e emissão de 5 nm. Efectuar as medições na presença de 50 nM de valinomicina para prevenir a formação de um potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: Na verdade, porque as bombas de prótons BR, há mais cargas positivas no interior do lipossoma do que fora. Esta cargagradiente podem ser descartados utilizando valinomicina, que é um K + ionóforo selectiva. Uma vez adicionados à valinomicina lipossomas suspensão, tal como uma molécula hidrófoba, se inserir na membrana do lipossoma, transportar passivamente K +, e, portanto, a dissipar o potencial de membrana ΔΨ.

Representative Results

O ensaio consiste de monitorização de piranina fluorescência como uma função do tempo, enquanto um gradiente de protões é gerado. Para esse fim, as amostras são submetidas a iluminação alternativamente (daí bombear protões pela BR é desencadeada) e, em seguida, para medições de fluorescência utilizando excitação e emissão de comprimentos de onda de piranina (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm). A Figura 1 mostra um controlo representativo obtidos com o ensaio, na ausência de mexa / MexB, verificando que o gradiente de protão gerado pela BR é reversível. Depois de um ciclo de acidificação, proteolipossomas são mantidos no escuro durante 45 minutos a fim de parar a BR para bombear protões (protões difundir lentamente e de forma passiva através de bicamadas lipídicas após o seu gradiente de concentração). Após este tempo de recuperação, a activação de BR é possível, simplesmente, iluminando a mesma suspensão novamente. Figura 2corresponde a uma medição de transporte real. Um controle negativo com lipossomas livres de proteínas mostra que, como esperado, o pH é constante sobre iluminação (Figuras 2A e 2B, os círculos de laranja). No entanto, proteolipossomas contendo BR nas suas membranas não bomba de protões, assim, o pH dentro dos lipossomas diminui e um gradiente estável é construído (Figuras 2A e 2B, quadrados roxo). Triângulos cinza e diamantes vermelhos (Figura 2A) representam pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB, na presença ou na ausência de Hoechst 33342, respectivamente. Observamos uma atividade independente do substrato onde o gradiente de prótons é apenas parcialmente dissipada por MexB contra-transporte. Atribuímos essa observação a uma atividade basal de MexB. A fim de testar o efeito de mexa na actividade de MexB, mexa foi adicionado para a reconstituição, o primeiro na ausência de qualquer tipo de substrato ( <strong> Figura 2B, diamantes azuis). Mais uma vez, o gradiente de protão gerado pela BR é apenas parcialmente dissipada. A medição de transporte real é realizado no mesmo exemplo. Previamente, o gradiente de protões deve ser reinicializado e o substrato tem de ser adicionado à suspensão a fim de atingir o seu sítio de ligação na proteína. Para esse efeito, a suspensão foi incubada no escuro, na presença do substrato durante 45 minutos. Após a iluminação posterior, pode-se ver que o gradiente de prótons gerado pela BR está agora totalmente dissipada por MexAB (Figura 2B, triângulos verdes), como conseqüência do transporte de substrato pela bomba. . Figura 1 Reversibilidade da gradiente de prótons construído pela iluminação BR: piranina fluorescência de proteolipossomos BR medidos em função do tempo. De 0-15 min, BR bombas de prótons como resultado da ativação de luz. De 15-60 min, proteolipossomas são incubados no escuro, durante este tempo, protões passivamente mova para fora dos lipossomas, até o pH intravesicular e pH extravesicular são iguais. De 60-75 min, BR ainda é funcional e bombas de prótons sobre iluminação. . Figura 2 Transporte ensaio: piranina fluorescência, convertidos para os correspondentes variações de pH, em função do tempo A) pH dentro dos lipossomas de controlo (círculos laranja); pH dentro de proteolipossomas contendo BR na membrana (quadrados roxo), pH dentro. de proteolipossomas contendo BR, e MexB na membrana sem Hoechst 33342 (d vermelhoiamonds); pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB na membrana com Hoechst 33342 (triângulos cinza) B) pH dentro de lipossomas de controle (círculos laranja);. pH dentro de proteolipossomos contendo BR na membrana (quadrados roxos); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana sem Hoechst 33342 (diamantes azuis); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana com Hoechst 33342 (triângulos verdes).

Discussion

Descreve-se um processo de reconstituição projetado para ensaio transporte de proteínas de membrana. Uma vez estabelecido, o processo de reconstituição da proteína leva à medições que são muito reprodutíveis. No entanto, as condições exactas para reconstituir a proteína irá variar a partir de uma proteína para outra. Muito cuidado deve ser tomado na otimização dos seguintes parâmetros: i) qualidade da purificação (pureza e ausência de material agregado); ii) a eficiência da etapa de detergente de solubilização (quando possível, de baixo detergente CMC devem ser preferidos porque são mais fáceis de obter livrar), iii) dessorção do detergente (que é por exemplo possível combinar o uso de esferas de poliestireno com um passo de diálise, mas este facto pode afectar a taxa de dessorção, um parâmetro crítico para a actividade posterior da proteína, ver ref [ 9]), iv) a reconstituição de lípidos (a natureza química do lípido, o lípido e o rácio de proteínas, a presença de amphiph adicionaliles são parâmetros críticos que devem ser variadas e otimizado). Na temperatura de adição e tempo de incubação afeta todas estas questões.

O controlo de qualidade é portanto primordial em cada passo do procedimento de reconstituição. Deste ponto de vista, de dispersão de luz é uma técnica muito conveniente porque é rápida, não destrutiva, e requer apenas 20 ul de amostra a uma concentração na gama micromolar. Uma vez que os proteolipossomas são formados, gradiente de sucrose é também de grande ajuda porque abre o caminho para uma verificação sistemática de reconstituição: qualitativa (a proteína é, de facto incorporada na membrana do lipossoma), bem como quantitativo (quantos proteína em um lipossoma). Este último seria abordada por medir com precisão a proteína e concentrações de lipídios.

Nosso ensaio não depende da titulação do próprio substrato e isso evita considerações inquietos a respeito de possível difusão passiva artifactual de molécula devido a partição hidrofóbica nas membranas. O ensaio explora as propriedades de piranina como sonda confiável e quantitativa de mudanças de monitoramento de pH. Nossos resultados estão de acordo com os resultados obtidos com outro procedimento onde a formação de gradiente de prótons foi realizada utilizando valinomicina ^10, mas permite um gradiente mais robusta e reproduzível ^11. Além disso, o gradiente de protões pode ser ajustada precisamente, simplesmente pela variação da concentração do tampão (para mais detalhes ver ¹² Verchere et al.).

No processo de uma medição de controlo é efectuado em primeiro lugar, na ausência de substrato (o que dá acesso à actividade passiva da proteína). A actividade efectiva transportador de proteína de membrana é então medida após o substrato ter sido adicionado na mesma cuvette. Este é verdadeiramente um activo porque o experimento pode ser considerado como um verdadeiro, resultado induzido pelo substrato não ambíguo,.

ent "> O protocolo pode ser adaptado para alto, médio rendimento (por exemplo, medições de 96-poços) automatização pois iluminar a amostra provoca a automatização e paralelização reacção. consistiria na preparação de um lote grande de proteolipossoma, e na distribuição de alíquotas em 96 poços de placa. substratos (e também possíveis inibidores) seria então adicionado e após a incubação no escuro durante 45 min, a placa de ser sujeito a ciclos de medição de fluorescência de iluminação / piranina num leitor de microplacas.

Para obter informações adicionais sobre o protocolo, os leitores são convidados a ler Verchere et al. ^12,13

Materials

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A